褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制论文.docVIP

　　褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制论文 【关键词】 阿尔茨海默病 摘要：目的 探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的神经细丝过度磷酸化中的影响及其机制。方法 采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2aelatonin on calyculin Ainduced neurofilament (NF) hyperphosphorylation in neuroblastma cells (N2aelatonin or CA and vitamin E, the levels of neurofilament phosphorylation and the level of PP2A ent led to neurofilament hyperphosphorylation by decreasing the level and activity of PP2A. Both melatonin and vitamin E had protective effect on calyculin Ainduced neurofilament hyperphosphorylation, although melatonin increased the activity of PP2A in E did not. Morever, melatonin partially attenuated the decreasing of PP2A level. Conclusion Melatonin protects neuroblastma cells from CAinduced neurofilament hyperphosphorylation through the regulation of PP2A level and the increase of PP2A activity. KEY )、高(NFH)分子量的三种亚基组成，它与微管、微管相关蛋白(包括tau蛋白在内)等其他骨架蛋白存在广泛的相互作用，并共同维持着细胞骨架的正常结构。Nancy 等证实异常过度磷酸化的神经细丝也是NFTs的重要组成成分，因此其在AD发病机制中的作用也日益受到重视。褪黑素(melatonin，Mel)是由松果体分泌的一种具有多种生物学功能的内分泌激素，随着年龄的增长其分泌量逐渐下降。研究发现AD患者脑脊液中Mel的水平显著低于同年龄正常人群，临床上AD患者给予Mel后，可以改善某些患者的认知功能。因此，Mel分泌紊乱在AD的发病过程中可能起重要作用。最近有人报道，Mel可阻断或逆转冈田酸(okadaic acid, OA)在神经瘤细胞(N1E115)引起的氧化应激、细胞凋亡和微管破坏。我们曾报道Mel可对抗花萼海绵诱癌素(calyculin A, CA)在SY5Y细胞引起的神经细丝过度磷酸化。为进一步研究Mel对抗CA引起的神经细丝过度磷酸化的机制，我们分别用Mel和维生素E(vitamin E, Vit E)与CA同时处理成神经瘤细胞N2aa公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司；硝酸纤维素膜(NC膜)为 Hybond公司产品；单克隆抗体SMI31(识别磷酸化的NFH、NFM，1∶5000)、SMI32(识别非磷酸化的NFH、NFM，1∶5000)、R123d(识别PP2A的催化亚单位，1∶1500)购自Sternberger公司，所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；辣根过氧化物酶标记的二抗和ECL显色系统购自Santa Cruz公司；CA购自美国Biochemical公司；γ32PATP购自北京亚辉生物医药公司。 1.2 细胞培养 鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2a Institute, La Jolla, California, USA)提供，细胞用含50g/L胎牛血清(FBS)的DMEM/OptiMEM(1∶1)培养基，在5%(体积分数)CO2、37℃培养箱内进行培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达约70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为6组：正常对照组，加入含DMSO( 0.01%体积分数)的培养基；CA组，加入5nmol/L CA；25mol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入25μmol/L Mel；50μmol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入50μmol/L Mel；100μmol/L Mel组，加入5nmol/L CA同时加入100μmol/L Mel；Vit E组，加入5nmol/L CA同时加入50μmol/L Vit E。