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2011-5-7;Western blot 定义;Western Blot操作流程;水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。;二、蛋白样品的定量(Bradford法 ); 20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本 ;Anode - 内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触;彬诧此宏秆公长肪审站皋掀劳浅扁臭鸵升桨宵衍琉游遁孰辉掂蹬侈赁舀托western blot原理与操作流程western blot原理与操作流程;四、Western Blot 转膜;五、封??;六、一抗、二抗孵育;七、二抗与底物反应显色;Western Blot 需要的主要试剂;WB需要试剂－膜;WB需要试剂－封闭试剂;主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。;WB需要试剂－一抗;杂交需要试剂－二抗;杂交需要试剂－底物;WB常见问题;标本问题 标本中不含检测蛋白：设置阳性对照 上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量 转膜问题 转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使用蛋白质Marker. 洗涤过度：减少洗涤时间和次数. 封闭 封闭过度：减少封闭试剂浓度，封闭时间，更换封闭试剂 抗体孵育和检测 抗体浓度和时间孵育不够：增加抗体浓度，延长孵育时间 一抗不工作：设置阳性对照 二抗不工作：和其他一抗配合检测二抗是否工作 一抗/二抗不匹配：检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗 底物失活：重新配制有效的底物;背景高;非特异性条带;条带大小不对;The end