核酸化学-授课版.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNA的部分变性 固定pH和离子强度下，仔细确定一种DNA的熔点可估算其碱基成分。假如变性条件被精确控制，虽然大多数DNA仍保留双螺旋结构，但富含A＝T碱基对的区域将被特定变性。 DNA杂交 6 核酸的含量测定 6.1 紫外吸收法 1 μg/mL RNA，其A260=0.020 1 μg/mL DNA，其A260=0.022 6.2 定糖法 DNA：二苯胺法 RNA：地衣酚法 6.3 定磷法 7 核酸酶系 7.1 核糖核酸酶类 ① RNase A（牛胰核糖核酸酶） 内切酶，对C，U专一 水解位点：嘧啶Nt右边的5′-磷酯键 水解产物：3′-嘧啶Nt或3′端以嘧啶Nt结尾 的寡Nt片断 ② RNase T1 从米曲霉培养液提取，内切酶，对G专一， 水解位点：G右边的5′－磷酯键 水解产物：3′-GMP或3′-端以Gp结尾的寡Nt片断 ③ RNase T2 从米曲霉培养液提取，内切酶，专一性稍差，主要作用于腺苷酸 水解位点：A右边的5′-磷酯键 水解产物：3′-AMP或3′端以Ap结尾的寡Nt片断 7.2 脱氧核糖核酸酶类 ① DNase Ⅰ（牛胰脱氧核糖核酸酶） 内切酶 水解位点：3′-磷酯键 水解产物：5′-磷酸为末端的寡Nt，平均长度 4 Nt ② DNase Ⅱ（牛脾脱氧核糖核酸酶） 内切酶 水解位点：5′-磷酯键 水解产物：3′-磷酸为末端的寡Nt，平均长度 6 Nt ③ 限制性内切酶 主要作用于异源双链DNA，具有严格的碱基 专一性，发现于细菌等微生物中，已鉴定的有 几百种；能识别特定的碱基序列，并在该序列 上或其邻近序列切割DNA； 产物：DNA片段，有粘性末端或平头末端 7.3 非专一性核酸酶类 ① 蛇毒磷酸二酯酶:核酸外切酶，从3′端逐个切 底物：DNA，RNA 水解位点：3′-磷酯键 水解产物：5′-Nt底物3′端有磷酸基时会抑制该酶活性 ② 牛脾磷酸二酯酶:核酸外切酶，从5′端逐个切 底物：DNA，RNA 水解位点：5′-磷酯键 水解产物：3′-Nt底物5′端有磷酸基时会抑制该酶活性 8.核酸和核苷酸的非酶转化－变异 脱氨基作用 脱嘌呤作用 紫外线诱导嘧啶二聚体形成 环丁烷胸腺嘧啶二聚体 6-4光生产物 环丁烷嘧啶二聚体的形成使DNA链中形成弯曲或扭曲 工业活动中产生的活性化学物质对DNA的伤害 这些化学物质本身并不有害，但可被细胞代谢成有害形式。 两类代表：(1)脱氨基试剂，特别是亚硝酸(HNO2)或能代谢为亚硝酸或亚硝酸盐的化合物；(2)烷化剂 氧化剂（激发态氧）如过氧化氢、羟自由基和超氧自由基等对DNA也有剧烈伤害 亚硝酸前体 烷化剂 氮芥子气 硫酸二甲酯 亚硝胺 二甲基亚硝胺 S-腺苷甲硫氨酸 硫酸二甲酯可甲基化鸟嘌呤生成O6-甲基鸟嘌呤，不能与胞嘧啶配对。细胞中正常存在的烷化剂如S-腺苷甲硫氨酸可导致许多相似的反应。 9.DNA中一些碱基的甲基化 所有已知的DNA甲基化酶都以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体 大肠杆菌含有两个明显的甲基化系统：一个作为防御机制部分，通过甲基标记自身DNA和毁灭未甲基化的外源DNA，以帮助细胞区分自身DNA和外源DNA；另一个系统由Dam（DNA腺苷甲基化酶）将连在序列GATC的腺苷残基甲基化为N6-甲基腺苷，在碱基错配修复中发挥作用。 真核细胞中，DNA大约有5％的胞苷残基被甲基化为5-甲基胞苷，在CpG序列中很常见，生成的甲基-CpG对称地分布在DNA双链上，在抑制转位子的移动中起重要作用。 10、DNA序列的测定－Sanger测序法 Sanger DNA测序法 以Sanger法为基础的DNA测序反应的自动化策略－DNA自动测序仪 11、DNA的化学合成 12、核苷酸的其他功能 12.1细胞中运输化学能量 12.2腺嘌呤核苷酸是许