液相色谱柱分类和维护.doc

液相色谱柱的分类和维护 一、色谱柱基本知识 色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10um等，柱效理论值可达5～16万／米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。 柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，也要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。 1.柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70Kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2-20um(5-10 um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出，柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。 2.柱的发展方向 因强调分析速度而发展出短柱，柱长3～10cm，填料粒径2～3um。为提高分析灵敏度，与质谱（MS）联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱（MICROBORE）。细管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；③样品量少；④能使用长柱达到高分离度；⑤容易控制柱温；⑥易于实现LC－MS联用。 但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1～100ul/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因进样量小，要求高灵敏度检测器，电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。 3.柱的填充 色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度20um 时，干法填充制备柱较为合适；颗粒20um时，湿法填充较为理想。填充方法一般有四种：①高压匀浆法，多有用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters 专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法，柱填充的技术性强，大多数实验室使用己填充好的商品柱。 必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。 二、液相色谱柱规格 色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类 ①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm,柱长10~30cm； ②窄径柱（narrow bore），内径1~2mm，柱长10~20cm； ③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm； ④半制备柱，内径＞5mm； ⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm； ⑥生产制备柱内径可达几十厘米。 色谱柱了解 1）平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度(dp)越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差) 颗粒分布 颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差) 颗粒形状球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀，谱带扩展 2）键合相化学 1.影响化合物的分离度： 2.不同键合相对不同种类的化合物分离不同a 3.可能导致色谱的分离机理不同3.如：C18、C8、CN 3）含碳量 1.含碳量越高，k‘值越大（固定相传质效应增加） 2.高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善 3.低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗 填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%） 不同色谱柱的含碳量如下所示： 4）填料的端基封口 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% - 1%） 5）硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为：k，生产硅胶时处理温