第五章 细胞分选.docVIP

细胞分选 细胞分离是指将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程。细胞纯化更进一步强调从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞的分离和纯化过程，使培养物成为单一类型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系。许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主的程度，所以也成称为富集。 分离和纯化细胞的过程不仅仅在原代培养之前进行的，有时分离和纯化细胞的过程还贯穿于原代培养和继代培养的过程中，甚至是主要依赖培养过程实现分离和纯化细胞的目的。培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物中的比例如何，常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标。细胞分离纯化的方法有密度梯度离心技术、逆流淘析分离技术、利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法等。 密度梯度离心技术 利用细胞体积和密度进行分离纯化的技术均基于沉降作用。其基本原理是，在离心力的作用下，细胞在一定介质中的的沉降速率与细胞的体积及细胞密度和其周围介质的密度之差成正比。细胞的体积越大，其余分离介质的密度差越大，则细胞的沉降速率越快。对于特定的待分离细胞来说，其体积和密度是恒定的，可供选择的只是具有一定密度与黏度的分离介质。使之沉降的细胞密度应该比介质大，而使之漂浮的细胞密度应该比介质小。通过这一技术可进一步分离淋巴细胞。 逆流淘析分离技术 通过含细胞介质溶液的流力和浮力与细胞所受离心力之间相互作用而分离细胞的一种技术。细胞置于一特殊的离心室中，离心室成锥形状，其定点指向沉降方向，细胞悬浮于以向心方向连续流动的介质溶液中，同时受到离心力的作用。当向外的离心力于内向的流立即浮力达到平衡时，每个细胞将按照它的的沉降速率达到其平衡位置。通过这一技术可进一步分离淋巴细胞和单核细胞。 选择性细胞凝集 羟乙基淀粉和甲级纤维素可以使红细胞形成大的“钱串”，加速其沉降，从而比其他细胞更快地从造血细胞悬液中沉降出去。这一方法通常用于快速去除大量成熟红细胞，而不会对有核细胞群造成太大的损失。但是，与上面提到的密度梯度离心和逆流淘析步骤一样，这一方法并没有使干细胞群相对于有核细胞发生太多的富集。 基于不同粘附特性的细胞分离方法 粘附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，使某些类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种能力；或某些细胞的粘附能力强，粘附作用快，而某些细胞的粘附能力弱或粘附作用慢。根据这些差异，可以分离或消除某些类型的细胞。这种将粘附较快的细胞与粘附较慢的细胞（货物粘附能力）的细胞分离开来并分别收集的处理过程就称为差粘附处理。差速粘附处理常用于分离细胞悬液中的成纤维细胞与其它组织细胞。 利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法 免疫溶解法 当补体存在时，用抗细胞某一表面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以是具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理，将消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞培养物中，使抗体及补体作用于具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原阴性的细胞进行富集。细胞溶解法适用于细胞悬液或细胞培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。 流式细胞分选术 利用一个或数个荧光基团标记的抗体与细胞孵育以进行标记，标记好的细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 免疫磁珠分选技术 用免疫磁珠做细胞分选是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。 原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。