电泳技术 - 生物化学与分子生物学.pptVIP

电泳的含义带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2. 分析某种物质的纯度及分子量 染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。 定量： 取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4N NaOH 4ml； 剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约半小时； 用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。 6. 计算： 光密度总和 T ＝ A+α1+α2+β+γ 白蛋白％＝A/T×100% α1球蛋白％＝ α1/T ×100% α2球蛋白％＝ α2/T ×100% β球蛋白％＝ β/T ×100% γ球蛋白％＝ γ/T ×100% 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰（Acrylamide,Acr）和甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide,Bis）在催化剂作用下聚合而成。 聚丙烯酰胺凝胶的特点：机械弹度好、弹性大、透明、化学稳定性高及无电渗等。 聚丙烯酰胺凝胶兼有电泳和分子筛的双重作用，分辨率高。 等电聚焦电泳 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。 等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。 两性电解质 － Ampholine(由瑞典LKB公司生产) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的, pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5。 实验操作及注意事项 1. 凝胶配制： 取10 × 0.5cm内径的玻璃管，选择底部较齐平的一端用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），从一端量出7cm作好标记，垂直放置。 按下表配制聚丙烯酰胺凝胶，见下页 注意事项： a. 按表中的顺序加入试剂，并摇匀。 b. TEMED最后加，注意混匀。TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 通过催化过硫酸 铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 c. 将长滴管及时清洗 剥胶 用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与玻璃管壁之间，边旋转边注水，使针头慢慢旋转前进。靠水流压力和润滑作用将玻璃管内壁与凝胶分开，最后可用洗耳球在玻璃管的一端轻轻加压，就可将凝胶从玻璃管内压出，凝胶盛于培养皿中。 测定样品pI 方法一：直接用PH试纸插入所需测定的蛋白区带中，此法虽然十分方便，但较为粗略。 方法二：将所需测定的蛋白区带用刀片切下，置于5ml蒸馏水的小烧杯中，经常搅拌，4小时后用PH计测其pI。 * 综合性设计性实验-3 蛋白质翻译后修饰位点预测 醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C 目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定 此实验共包括如下三个部分 第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测 第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳 第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定 第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测 泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用； 磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程； 糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用； 脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用； 组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。 蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。 甘露糖化修饰预测 ：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/ N位糖基