慢病毒实验方法课件.docVIP

慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定 试剂、耗材及仪器 试剂 1.1.1 商品化试剂及试剂盒 名称 厂家 货号 Lenti-X 293T Cell Line clontech 632180 DMEM Gibco T Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin Life Technologies 10099-141 Lipofectamine? LTX Plus Reagent invitrogen 15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 12143 1.1.2 试剂配制 a. 氨苄青霉素储液 称取10g，加8ml 超纯水，，定容至10 ml，分装，保存。称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10 NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌，4保存。保存。保存。加800 ml 超纯水，调节pH至7.，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌，4保存。 25cm2 Growth Area Flasks corning 430639 75cm2细胞培养瓶 corning 430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning 430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning 430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning 430293 6孔细胞培养板 corning 3516 外旋盖冻存管 corning 430659 15ml尖底离心管 corning 430790 50ml尖底离心管 corning 4558 3毫升吸管 Biologix 30-0138A1 1.3 仪器 名称 仪器厂家 仪器型号 二氧化碳培养箱 Thermo 371 生物安全柜 Thermo Forma Class II，B2 倒置荧光显微镜 OLYMPUS IX71 台式高速冷冻离心机 Thermo LEGND MACH 1.6R 小型高速离心机 Thermo LEGEND MICRO 17 小型冷冻高速离心机 Thermo LEGEND MICRO 17R 超低温冰箱 SANYO MDF-U73V 冰箱 Haier BCD-290W 二、方法 2.1．包装细胞准备 细胞复苏 a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）； b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中； c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀； d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清； e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养； f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代； 2.1.2细胞培养 a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。 2.1.3细胞保种 a. 冻存液：10％DMSO血清来配制冻存液。 离100 g，5 min），小心移除上清； c. 加入冻存液混匀，分装 至2ml冻存管中，密封后应标记冷冻细胞名称和冷冻日期，然后放入梯度降温盒，置于-80℃过夜，次晨置于液氮罐中保存。 2.2. 质粒中量提取 按照QIAGEN-Plasmid-Purification-