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Neon 演示准备及操作步骤 一、 材料准备： 以24 孔板培养为标准： 1．细胞： 5 数量要求：0.5-5*10 cells/well 10μL体系，贴壁细胞，需要0.5-2*105 cells /well。 5 10μL体系，悬浮细胞，需要0.5-5*10 cells /well。 Note ：保证细胞状态比较好，密度在70%-90% ，在实验当天消化细胞，计数，计算活率。 建议使用Countess 细胞计数仪，30 秒内获得准确的细胞量以及细胞存活率。 2 ．质粒： 浓度要求：1-5μg/μL，10μL体系加入的量不能超过 1μL,根据下面具体的数据调整： 10μL体系，贴壁细胞，加入的质粒量为0.5μg/well。 10μL体系，悬浮细胞，加入的质粒量为 1μg/well。 Note ：DNA 纯度要高，以去离子水或TE 溶解。 建议使用Invitrogen 的PureLink Hipure plasmid kit 或者PureLink Hipure plasmid filter kit 抽提质粒。 不建议使用国产试剂盒。 加入质粒的体积不能超过转染总体积的 10%。 3 ．siRNA （做RNAi 的客户）： 浓度要求：500μM- 1mM，根据下面具体的数据调整： 10μL体系，贴壁细胞，siRNA 的终浓度为100nM 10μL体系，悬浮细胞，siRNA 的终浓度为200nM Note ：高质量的siRNA 双链，溶于无核酸酶的水中。 建议使用Invitrogen 的stealth siRNA。 加入siRNA 的体积不能超过转染总体积的10%。 4 ．培养基： 实验当天，24 孔板中准备好含血清及添加剂，不含抗生素的培养基（与您需要转染细胞的一致的培养环境， 0 仅扣除抗生素），500μL/孔，37 C 孵育备用。 5. 耗材及试剂： 移液枪 （至少20/100/1000μL各一支）一套； 灭菌的枪头（10/200/1000μL各一盒）； 灭菌的PBS 缓冲液，不含钙镁离子； 胰酶、血清及各种培养基添加剂等； 75%酒精（棉球或喷壶都可以）； 灭菌的离心管（1.5mL 及 15mL 各一盒）； 未开封的24 孔细胞培养板； 一次性无菌手套若干； 已经过紫外处理超净工作台或安全柜； 记号笔； 白大褂； 插线板（如电源离操作台面距离过远）； 低速离心机； 二氧化碳培养箱等常规设备。 二、 操作进行： 1. 仪器连接：必须保证连接紧密 图1，移液枪基座与主机连接 图2 ，电源线与主机连接 2. Tube 管安装：电极要对正 （可听到咔嗒一声） 如图3，将tube 管放置在基座上面，并加3mL 的E Buffer 3. 用移液枪安装一个 Tips ，并吸取混匀的细胞和质粒 （采用R Buffer 重悬），放置到基座上： 4. 调整参数，按“Start”键：触摸屏上显示 Complete (完成)，说明电穿孔已完成 5. 取下移液枪，将样本转移到培养基中： 6．其他样本操作一样，最后电转结束，将培养板放置于37℃培养箱中培养。仪器放回包装箱。 7. 用户根据自己试验安排进行结果观察或检测。如果对试验环节或者结果有疑问，可咨询Technical Support 。