细胞骨架蛋白免疫荧光染色.ppt

间接免疫荧光细胞化学法 显示细胞骨架 【实验目的】 熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。 掌握荧光染料染色方法并观察其发出的荧光。 掌握免疫荧光细胞化学染色法的原理及操作步骤。 掌握用间接免疫荧光细胞化学染色法显示目前抗原的方法。 【实验原理】 细胞骨架是维持真核细胞形态及参与一系列细胞生物学功能的重要细胞器，微丝属于其中的重要成员，其中又以肌动蛋白（actin）纤维作为主要成分。细胞中的肌动蛋白以网络状分布于胞质中，大多数细胞均呈高表达。采用人actin或tubulin的单克隆抗体结合该抗原，再使用FITC和Rhodamine标记的山羊抗小鼠二抗与一抗结合，最终细胞中的绿色或红色荧光显示了目的抗原的存在。 【实验准备】 1、材料 体外培养的人肺癌细胞的飞片。 2、试剂 0.01MPBS溶液（pH7.4）：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，NaH2PO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，蒸馏水定容至1000mL；抗体稀释液（含BSA）；并甲醇或冰丙酮；5%正常山羊血清封闭液；0.5mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液：NaHCO3 3.7g，Na2CO3 0.6g双蒸水800mL；碱性缓冲甘油溶液：碳酸缓冲液1份与甘油（试剂级，无荧光）9份混合均匀；小鼠抗人actin的单克隆抗体；FITC或Rhodamine标记的山羊抗小鼠二抗。 3、仪器等 超净工作台，CO2培养箱，倒置相差显微镜，科学级荧光显微镜，冰箱，微量加样器，移液管，吸管，细胞培养瓶，24孔培养板，湿盒，试管架，眼科镊，培养皿，滤纸，载玻片、MARK笔。 【实验内容与方法】 从24孔培养板中取出培养的肺癌细胞飞片，PBS冲洗3-5分钟/次*2次。 吸弃PBS，加入4℃冷甲醇固定10分钟。 PBS溶液冲洗5分钟*2次。 吸弃PBS，滴加10%BSA封闭液，将飞片放入湿盒，室温下封闭10分钟。 吸去飞片上的封闭液，不冲洗飞片，在飞片上滴加稀释好的抗actin一抗（稀释浓度需提前经过预实验选择好），在湿盒中孵育1小时。 用PBS冲洗10分钟*3次。 在飞片上滴加二抗稀释液（稀释浓度需提前经过预实验选择好），室温下于湿盒中避光孵育40分钟。 吸弃二抗液体，用PBS冲洗10分钟*3次。 加入DAPI（1：2000），放置10分钟，使用PBS洗3次，干燥飞片。 滴加约5μL封片剂于载玻片上，将飞片细胞面向下盖于封片剂上，避免产生气泡，封固后荧光显微镜观察。 观察结果 肺癌细胞胞质中绿色或红色荧光所在区域即为actin的存在部位，在100倍油镜下可以观察到tubulin呈绿色或红色丝网状均匀分布于胞质中。 为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除非特异性染色导致的假阳性结果，必须设立对照实验： ①阴性对照：用PBS或非免疫的二抗动物血清代替一抗，再用以上方法进行染色，结果应为阴性。 ②阳性对照：用已知含有待测抗原的阳性细胞进行以上染色，结果应为阳性。