不同醇沉材料醇沉效果研究.docxVIP

 PAGE \* MERGEFORMAT6 TT24不同醇沉材料醇沉效果研究 一、实验名称： 不同醇沉材料醇沉效果研究 二、实验目的： 研究不同醇沉材料对醇沉效果的研究，以此来选定最好的醇沉材料做为以后的生产。 三、实验设计： 方法：控制变量法 实验中只改变醇沉材料，即国药异丙醇和科密欧异丙醇，其他条件都不变。 三、实验步骤 （一）大肠杆菌的培养 1、菌种复苏： 取10ml LB培养于50ml离心管中，在超净工作台中，接100ul保存菌种，并按1:1000的比例加50mg/ml的壮观霉素，37℃，200rpm，摇2小时。（此步需摇6个离心管） 2、扩大培养 2.1在18个2L锥形瓶中分别配制1L LB培养基，灭菌，冷却至室温； 2.2在超净工作台中，把复苏的菌种直接加入培养基中，按1:1000加入壮观霉素，37℃，200rpm，摇过夜（16-18h）。 （二）质粒粗提 1、大肠杆菌收集：培养好的菌液倒入1L离心瓶中，配平，于大型冷冻离心机中， ，7000rpm，离心30min；（共六个离心瓶，一次收集6L，分三次收集）； 2、在六个离心瓶中分别加入75ml的SolutionI（配方见附录），强烈震荡至充分混匀可用枪头吹散菌体（摇晃时看不到块状菌体，似牛乳状）； 3、将六瓶液体倒成三瓶，空瓶洗净并晾干备用； 4、向三个离心瓶中各加入300ml的Solution II（配方见附录），立即轻柔充分摇动，不能太剧烈。开始时会出现絮状粘稠物质，后面溶液会变澄清。室温放置10min（要精确计算时间，一定不能超过10min，否则会基因组DNA污染）； 5、各加入225ml遇冷的Solution III，（此时会出现白色沉底）立即轻柔充分摇晃，至沉淀散开；4℃静置30min； 6、配平后，于大型冷冻离心机中，7000rpm，4℃，离心30min以上 7、取若干个专门的滤器分别将上清过滤到已经洗净晾干的另外四个个离心瓶中，四个离心瓶分为两组，分别在其瓶盖和瓶身标记上G1、G2、K1、K2，G代表国药生产的厂家的异丙醇，K则代表科密欧生产的异丙醇。 8、向G1和G2离心瓶中分别加入0.6倍上清体积的国药异丙醇，向K1和K2离心瓶中加入0.6倍上清体积的科密欧异丙醇，摇匀后分别放入-20℃冰箱3h； 9、于大型冷冻离心机中， 7000rpm，4℃离心30min以上（此时会出现沉淀），倒掉上清，留取沉淀。 （三）无内毒素质粒抽提 进一步提纯 1、向上步核酸沉淀中各加入45ml P1，震荡使沉淀完全溶解（注意，P1使用之前应先确定其中已经加入了RNA酶，并进行标记，使用完后放入冰箱中保存）； 2、各加入45ml P2，立即温和颠倒离心瓶数次，使充分混匀，室温放置5min； 3；各加入45ml P4，立即温和晃动颠倒数次，使充分混匀；然后室温放置10 min左右 4、于大型冷冻离心机中，7000rpm，离心30min，可适当增加离心时间； 5、取若干个专门滤器将上清小心过滤到两个1L离心管中，并同上在瓶盖和瓶身标记G和K，代表不同的异丙醇。 6、分别向离心管中加入0.3倍上清体积的异丙醇，摇晃混匀； 7、将溶液放入-20℃冰箱中3h以上（可过夜）。 质粒柱式抽提 1、柱平衡：取18个CP6吸附柱（吸附柱放入50ml收集管中），分别编号G1、G2、G3、G4……G9，K1、K2、K3、K4……K9，每一个加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中； 2、过柱：取8ml左右G1瓶中滤液加入G1、G2、G3…….G9吸附柱内（最多不能超过盖子底部），同时取8ml左右K1瓶中滤液加入K1、K2、K3、K4……K9吸附柱内，盖严盖子，8000rpm离心2min，弃滤液。此步多次进行，至所有的滤液全部过柱子； 3、漂洗：向18个吸附柱中分别加入8ml的漂洗液PW（注意：使用之前先确认是否已经加入无水乙醇）,8000rpm离心2min，弃废液； 4、重复步骤漂洗一次； 5、醇洗；向18个吸附柱中分别加入3ml无水乙醇，8000rpm离心2min，弃废液； 此步骤之后或提前取一个50ml离心管，加35ml洗脱液（ TB buffer或ddH20），水浴锅加热至65℃备用。 6、将吸附柱重新放回收集管中，8000rpm离心3min； 7、将吸附柱放入18个新的收集管中，打开吸附柱盖子5min，晾干柱子； 8、质粒洗脱：洗脱方法如下 （1）取4ml洗脱液加入到管中，静置1min后8000rpm离心2-3min； （2）将G1、G2、G3、G4……G9和K1、K2、K3、K4……K9吸附柱中的洗脱液分别收集到两个标记有G和K的100ml离心管中； （3）