650nm半导体激光对豚鼠眼底视网膜细胞凋亡的影响.DOC

编号：201001004 短篇论著 文章编号： 650 nm半导体激光照射豚鼠视网膜的细胞凋亡及Fas蛋白的表达 吴小兰1，邱良秀2，王双勇2 ，刘文陆3 ，徐惠4 ，周和政5 （430063武汉，武汉理工大学：1医院，3物流学院；430030武汉，华中科技大学同济医学院：2附属同济医院眼科，4超微病理研究室；430070武汉，广州军区武汉总医院眼科5） [摘要] 目的 探讨650nm半导体激光照射豚鼠视网膜后的细胞损伤情况。方法 根据650nm半导体激光照射功率及照射次数的不同，将豚鼠分为9组。用TUNEL检测豚鼠视网膜细胞凋亡，用免疫组织化学法和医学图像分析法检测Fas蛋白的平均光密度值，用透射电镜观察视网膜细胞的形态学变化。结果 不同照射功率组凋亡指数(AI)有统计学差异(P0.05)，其中对照组与2、3 mW处理组间AI无统计学差异(P0.05)，不同照射次数对AI影响无统计学意义(P0.05)；不同照射功率组间Fas光密度值(ALD)有统计学差异(P0.05)，其中对照组和2mW处理组间Fas ALD无统计学差异(P0.05)，不同照射次数对Fas ALD无统计学差异( P0.05)；透射电镜观察，对照组及2mW处理组未见明显损伤反应；3mW处理组视网膜少许细胞变性，而在4mW和5mW处理组细胞变性明显增加。结论 照射功率在3mW以上的豚鼠视网膜存在细胞凋亡，Fas蛋白的表达也存在异常，说明3mW以上的650nm半导体激光照射豚鼠视网膜存在损伤反应。 [关键词] 半导体激光；视网膜；细胞凋亡 650nm半导体激光是否会对视网膜结构及细胞造成损伤，目前少见报道。我们研究了该激光照射豚鼠视网膜后的细胞凋亡及Fas蛋白的表达，并试图探讨其作用机制。 1材料与方法 1.1 实验对象与主要材料 4～5周豚鼠45只，体质量100～150g，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。RS-100型半导体激光弱视治疗仪(武汉亚昆光电子有限公司)，发射波长650 nm，功率有2 、3 、4 、5 mW 4种，光斑直径6mm；原位细胞凋亡检测试剂盒(德国Roche公司)，即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒(武汉博士德生物公司)。 1.2 分组 根据照射功率的不同将45只实验动物按随机数字表法分为正常对照组(n=5)、2 mW处理组(n=10)、3 mW处理组(n=10)，4 mW处理组(n=10)和5 mW处理组(n=10)，每个处理组下设每天照射1次（n=5）和每天2次（n=5）。 1.3 实验处理 固定豚鼠四肢，做内、外直肌牵引线固定眼球，根据各组功率及照射次数不同，用RS-100型半导体激光弱视治疗仪经瞳孔照射眼底视网膜，光束垂直于角膜顶点部，视网膜距离光源约33 cm，每次3 min，持续30 d。每天照射在固定时间进行。每组动物均在相同光线条件下正常喂养，其间用0.25%阿托品滴眼液充分扩瞳。实验结束时，处死动物，取眼球组织。 1.4 透射电镜观察　 豚鼠眼球组织取材后分为2份，一份置于4%中性甲醛中固定，以备凋亡及免疫组织化学检测用。另一份置于2.5%戊二醛固定2 h，磷酸缓冲液漂洗2次，1%锇酸固定20min，梯度乙醇丙酮脱水，Epon812包埋，半薄切片光镜观察定位后制作超薄切片，醋酸双氧铀/柠檬酸铅染色, FEI Tecnai G2 12型透射电镜（荷兰飞利浦公司）下观察。 1.5 TUNEL检测　 豚鼠眼球组织于4%中性甲醛固定48 h后石蜡包埋，4μm切片，具体操作步骤按说明书进行，最后DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。结果判定：阳性反应为细胞核染成棕黄色。每个标本中任意1张玻片有阳性细胞即认为TUNEL反应阳性。计数5个随机高倍视野(×400)下的阳性细胞数，以凋亡指数(AI)评估细胞凋亡程度（AI=阳性细胞数/细胞总数×100%）。 1.6 免疫组织化学反应　 豚鼠眼球组织采用SABC法进行Fas免疫组化染色，具体步骤按试剂盒说明书进行。结果判定：阳性细胞为细胞质和/或细胞膜棕黄色染色。每张切片随机采集5个高倍视野，所见视野输入计算机,经HPIAS-1000型全自动医学彩色图像分析系统(华中科技大学同济医学院病理教研室)分析处理,得到5个视野的平均光密度值(ALD)，ALD越大,表明表达水平越高。 统计学方法：数据以±表示, 。n=45,±S） 组别 AI（%） Fas ALD 照射1次 照射2次 照射1次 照射2次 对照组 17.07±3.63 17.07±3.63 163.26±5.06 163.26±5.06 2mW 18.05±4.37 18.49±4.44 160.94±5.21 163.48±5