ELISA法定量检测各类商品中黄曲霉毒素B1时存在的基质效应.PDF

ELISA法定量检测各类商品中黄曲霉毒素B1时存在的基质效应 Quantitation of Aflatoxin B1 by ELISA in Commodities that Pose a Matrix Effect Thu Hyunh, Ph.D,, Chritina Ly, Peter Knight, Ph.D, and Wondu Wolde-Mariam (Presented at AOAC 126th Annual Meeting, Oct 1, 2012) 摘要 黄曲霉毒素B1 是存在于各类食品和饮料中主要的真菌毒素残留和致癌物质。酶联免疫 吸附测定（ELISA）已长期用于定量检测真菌毒素的含量，因为它们操作简单、快速，可高 通量检测。另外，ELISA 比较轻便，并可用于一些需要快速出具真菌毒残留检测结果的领 域。ELISA 的一个缺点是基质效应，有些商品中的成分可能会干扰该测定，并导致比预期 值高或低。以前，我们开发了一种黄曲霉毒素B1 低基质ELISA 试剂盒用来定量检测小麦， snaplage，玉米，干草，辣椒，开心果，花生的黄曲霉毒素B1 残留。在此次研究中，我们 扩展了可以用黄曲霉毒素 B1 低基质 ELISA 试剂盒测试的商品列表。我们研究了使用这种 试剂盒准确定量检测广泛的粮食商品包括常见的烹饪调料、油、烹饪酱油和动物饲料的黄曲 霉毒素B1。通过对各种商品的提取方法的稍作调整，这些商品的黄曲霉毒素B1 回收率可 以达到 80 ％或更高。简言之，我们已经开发出最小基质效应的，可以检测多种商品的一种 黄曲霉毒素B1 试剂盒。结论是，黄曲霉毒素B1 低基质ELISA 试剂盒是用来监测和确保世 界范围内的食品安全的一种廉价的，并且非常有价值的工具。 材料和方法： 材料: 黄曲霉毒素B1 低基质ELISA 试剂盒是在实验室条件下准备的（HELICA 生物系统公司， 圣安娜，CA）。乙腈和黄曲霉毒素B1 （AFB 1 ）标准品采购自Sigma 公司 （圣路易斯，密 苏里州）。所有的调料，油，酱油，和动物饲料是从当地市场或食品供应商店（圣安娜，CA ） 获得。 方法： 提取和稀释 在加标回收研究中，对饲料和香菜种子进行细磨。对于饺子酱油、食用油和普通酱油， 样品进行加标并涡旋后立即提取。对于所有其他商品，提取之前，对已添加有AFB1 的商品 在室温过夜干燥。 将样品按照标准方案提取 （图1）。一定量或一定体积的样品转移到容器中，并与提取 溶剂混合。对于固体商品，用于分析的样品量为2-20g 。对于油和酱油，用于分析的样品为 10-20 毫升。经过与100-200mL 80 ％乙腈短时间混合后，离心样品，收集上清液用于分析。 进行分析之前用PBS-T 稀释样品。 ELISA 方法 ELISA 实验需要根据制造商的说明书 （HELICA Biosystems 公司，圣安娜，CA ）进行 操作。简单地说，使用之前 ELISA 试剂盒所有试剂需要恢复至室温。将 200 μL 稀释液转 移到相应的混合微孔中。100 μL 的标准品或样品分别移至相应的混合微孔中，并混合。将 100 μL 混合液转移到相应的抗体包被的微孔中，每份两个平行样，并在室温下温育 30 分 钟。用 PBS-T 将微孔洗涤三次并拍干。100uL 黄曲霉毒素 HRP 藕合物加入到各包被抗体 的微孔中，并在室温下孵育30 分钟。用 PBS-T 将孔洗涤三次，并拍干。100 μL 的TMB 底物加入每个微孔中并室温下温育 10 分钟。100 μL 终止溶液加入到每个孔中。用 StatFax2100 （Awareness Technology Inc ，棕榈市，佛罗里达州）在450nm(630nm)波长 下读取吸光度值。 计算与分析 ％B/B0 的计算是通过样品OD 值除以 0ppb 标准品OD 值再乘以 100 所得的百分比。 标准品浓度的对数值沿着x 轴绘制。相应的％B/B0 值沿着y 轴绘制。ReaderFit 软件（Hitachi Solutions America Ltd，旧金山，CA ）可用于绘制拟合标准曲线 （四参数拟合方程），再利 用标准曲线读出加标样品浓度值。计算最终浓度时稀释因素考虑在内。 为了评估基质干扰，空白样品和商品提取液分别进行20 次重复的检测。使用Microsoft Excel 进行 Stutent`s t-检验分析，以确定商品提取液和单独的提取溶剂各自测定值的平均 值之间是否存在统计学显著差异。p