T POWER038 OPA 衍生反应辅助试剂有硫醇存在时.PPT

氨基酸分析 1958 Spackman, Stein and Moore 第一次实现氨基酸自动分离和定量 氨基酸衍生化方法 柱后衍生 柱前衍生 柱后衍生化分离柱 阳离子交换柱 使用阳离子交换柱，峰分离度较差。 分析所有的氨基酸所需时间较长。 蛋白质水解氨基酸 (45 min) 生物体氨基酸 (120 min) 茚三酮方法 茚三酮方法 OPA 方 法( 邻 苯 二 甲 醛) 脯氨酸和羟基脯氨酸分析 脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂 发生反应 在与OPA反应前两种氨基酸应先使 用下列试剂进行氧化 次氯酸盐 氯胺－T OPA 衍生反应辅助试剂 有硫醇存在时，OPA才会与伯氨基酸发生反应 OPA 方 法 茚三酮方法和OPA方法比较 柱前衍生分离柱 反相色谱柱 (ODS) 使用反相柱，色谱峰分离良好。 分析某些类型的氨基酸所需时间很短 蛋白质水解氨基酸 (20 min) 生物体氨基酸 (60 min) OPA Method(o-phthaldialdehyde) OPA柱前衍生化色谱图 FMCO 方法(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride) 通用试剂，用于缩氨酸 N端保护 荧光胺方法 pH＝7时与伯氨基酸快速反应 易于水解 DANS-Cl 方法(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride) 与伯氨基酸和仲氨基酸反应效率低 PITC 方法(phenylisothiocyanate) For peptide and protein sequencing as Edman抯 reagent 伯氨基酸和仲氨基酸 (碱性条件) 反应时间长 使用UV检测器，灵敏度低 PTC - 氨基酸色谱图 自动氨基酸分析仪 对于“ 柱前”和“ 柱后”自动氨基酸分析仪来说，采用何种方法更好？ 要控制反应时间，采用柱后衍生方法更方便。 这就是为什么采用柱后衍生法所得结果之重复性更好的原因。 柱后衍生重复性, RSD 约为 1% 柱前衍生重复性, RSD 2% Shimadzu 氨基酸分析系统 氨基酸分析流程图 分离柱 强酸性阳离子交换树脂 (带有磺化基团的苯乙烯－二乙烯基苯共聚物) Na型 and Li型 Shim-pack AMINO-Na ，用于水解氨基酸分析 Shim-pack AMINO-Li ，用于生物体氨基酸分析 水解氨基酸色谱图 生物体氨基酸色谱图 流动相 [ Na型 ] A 溶液 : 0.2N 柠檬酸钠 (用高氯酸调 pH至 3.2) B 溶液 : 0.6N 柠檬酸钠 / 0.2M 硼酸 (用4M NaOH调 pH至 10.0) C溶液 : 0.2N NaOH(用于清洗色谱柱) [ Li 型] A 溶液 : 0.15N 柠檬酸锂 / 7% 甲氧基乙醇 (用硼酸调 pH至 2.6) B溶液 : 0.3N 柠檬酸锂 / 0.2M 硼酸 用4M LiOH调 pH至 10.0) C 溶液 : 0.2N LiOH (用于清洗色谱柱) PH梯度 N-acetylcystine作为辅助试剂 什么是氨捕集柱? 重复性 (各250 pmol) 线性 高灵敏度分离色谱图 样品预处理 脱脂 去蛋白 蛋白质水解 样品稀释 过滤 脱脂 脂类组分会影响分析柱 使用弱极性溶剂 乙酸乙酯 氯仿 正己烷等 两相分离后, 水相必须使用0.45 um 滤膜过滤 除蛋白 蛋白组分会干扰氨基酸的分离 除蛋白试剂 酸性溶剂方法 有机溶剂方法 超滤方法 蛋白沉淀物必须采用离心 (3000 rpm, 5 min) 或过滤方法除去. 酸性溶剂方法 三氯乙酸 (5-10% 水溶液) 高氯酸 (0.1 - 1% 水溶液) 除去蛋白后, 通过加 NaOH or LiOH 以中和溶液 (溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.) 有机溶剂方法 乙腈 乙醇 聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。 如果采用有机溶剂方法, 进样量应尽可能小。 超滤方法 效率高 成本低 老鼠血清中游离氨基酸分析 猪血粉中游离氨基酸分析 茶叶中游离氨基酸分析 蛋白质水解 (1) 高氯酸水解方法 6N - HCl 110C (N2氛围) 22 - 72 hours 色氨酸, 半胱氨酸,蛋氨酸分析不能用此水解方法 (可用其它方法). 天冬酰胺酸和 谷氨酸 转换成酸的形式。 蛋白质水解 (2) 碱水解方法 4N NaOH 110C (N2