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杂交瘤技术与单克隆抗体概要 摘要：用绵羊红细胞免疫B A L B / C 小鼠, 取其脾淋巴细胞与同品系小鼠的骨髓瘤细胞融合, 形成的杂交细胞能分泌脾淋巴细胞的单一型抗体分子, 又具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性。这种杂交细胞叫做杂交瘤。杂交瘤能在离体培养条件下分泌抗体,如果移植在同品系或 F 1小鼠体内, 在其血清或腹水中可以获得较高浓度的抗体。这种抗体是由单一增殖的纯系细胞分泌的单克隆抗体。由于其纯度高、 特异性强、可以复制[1],这种技术自问世以来已广泛应用于疾病的免疫诊断、免疫治疗和免疫预防等各个领域[2]。本文对杂交瘤技术的基本原理、程序、工作中注意问题、优点及应用等进行了综述。 关键词：杂交瘤技术 基本原理 程序 注意问题 优点 应用 自从1975年Kohler和Milstein建立杂交瘤技术以来[3]，淋巴细胞杂交瘤技术在许多研究实验室成为产生特异性抗体的重要工具，日益引起基础科学和临床工作者以及工业家的注意[4]。许多科技工作者开展了这项新的生物技术的研究和应用,该技术不仅促进了现代医学、微生物学、肿瘤学、免疫学、寄生虫学和药学等学科的发展，并且正在从生物医学领域向工业、农业和牧业等新领域渗透，取得了一定的成果。[5] 对其今后的发展和应用，N.A.5taines[6]和A.W.Edwards[7]都有较详细的叙述。1979年我国引入了这项技术，并分别在北京、上海举办多次培训班，推广该项技术,[8]开展了杂交瘤技术的研究[9-10],并且取得显著成绩，但是由于国内的设备和物资条件的影响，杂交瘤技术开展比较慢，仍需迎头赶上。 1 单克隆抗体的概念 单克隆抗体是由一个淋巴细胞增殖分化形成一个基因相同的细胞群称为克隆，或无性繁殖细胞系（简称细胞系），由单一克隆产生的抗体称为单克隆抗体。众所周知，我们人体或动物体受天然抗原刺激后产生的抗体是多种抗体组成的混合抗体，即所谓的多克隆抗体。因为天然抗原成分很复杂，它含有多种不同性质的分子，每个抗原分子上又带有若干不同的抗原决定簇。每个B淋巴细胞系只能产生一种它专有的、它能识别的特异性抗原决定簇。所以只有从一株单细胞系产生的抗体，才称为单克隆抗体。[11] 2 杂交瘤技术的基本原理 小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖。采用融合剂聚乙二醇（PEG）等将这两种细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特征。既能在人工培养下无限增殖，又能产生特异性的抗体。由于每一个被免疫的淋巴细胞只能对某个单一的抗原决定簇产生特异性抗体，因而在将其克隆化后产生的单克隆细胞系，就能产生大量单一的高纯度抗体，即“单克隆抗体”。 细胞融合培养时加入HAT（H- 次黄嘌呤、A- 氨基喋呤、T- 胸腺嘧啶） 选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞的生长。融合细胞能在HAT 选择性培养基上生长的原理是:在HAT 系统中，A 阻断了核酸合成的主要途径，这时正常细胞可以通过“补救途径”，由胸腺嘧啶激酶（TK）和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用T 和H 合成核酸。骨髓瘤细胞，因缺乏HGPRT 不能利用“补救途径”，所以在HAT 系统中不能存活。而骨髓瘤细胞和脾细胞的杂交细胞，从正常的脾细胞获得了HGPRT，能够存活。正常脾细胞没有在体外长期生长的能力。[12] 3 杂交瘤技术的程序 这项新技术所需设备较简单, 而且容易掌握, 在普通的无菌室内就能开展工作。 3.1细胞融合和杂交们细胞的培养 选用经某种抗原免疫过的B A L B / C 小鼠的脾细胞和同种小鼠的骨髓瘤细饱, 在细胞融合诱导剂—聚乙二醇的作用下, 使细胞融合而形成杂交瘤细胞。然后, 添加适量的含15%小牛血清的RPMI 16 4 0 完全培养液。最后, 把杂交瘤细胞分装在96孔平底培养板内, 用含有次黄嘌吟、氨基蝶吟和胸腺嘧啶核苷的选择培养基(H A T ), 在充有5 %CO 2 的37 ℃培养箱中培养。杂交瘤细胞由于具有亲本—脾B 淋巴细胞所提供的次黄嘌吟磷酸核糖移换酶和胸腺嘧啶核苷激酶, 因而在嘌呤和嘧啶的主要生物合成途径, 已被叶酸拮抗剂—氨基喋吟阻断的情况,仍可通过“补救途径”利用次黄嘌吟和胸腺嘧啶核苷合成相应的核苷酸, 进而生成D N A , 这样杂交瘤细胞就能够在H A T 培养基中生长和繁殖。而所用的骨髓瘤细胞因没有“补救途径”所需的次黄嘌吟磷酸核糖移换酶, 就不能在H A T培养基中生存。脾B 淋巴细胞在体外培养, 生存时间也较短。经10 一15天后, 形成杂交瘤细胞集落, 改用无氨基喋吟的H T 培养液继续培养。 3.2杂交们细胞的筛选和克隆化 杂交瘤细胞的筛选试验应该可靠而快速。常用的筛选方法有三种: 固相放射免疫吸附法—抗原与固相