基于远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶活性检测方法的建立.DOC

基于远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶活性检测方法的建立 程燚1，王东1，李梦侠1*（400042 重庆，第三军医大学：大坪医院野战外科研究所 肿瘤中心1）[摘要] 目的 建立远红外荧光标记的AP核酸内切酶活性检测方法。方法 通过5’标记远红外荧光基团（IR700）合成得到AP核酸内切酶活性检测底物，并通过与经典的同位素法对比，检验建立方法的可靠性、灵敏度及实用性。结果 远红外荧光标记法较传统的同位素法检测AP核酸内切酶得到几乎相同的结果，操作时间从传统的1天缩减至2小时。结论 远红外荧光标记法检测AP核酸内切酶活性更敏感，且操作方便、无放射性污染，易于推广。 AP核酸内切酶活性检测；远红外 ESTABLISHMENT OF APURINIC/APYRIMIDINIC ENDONUCLEASE ACTIVITY ASSAY BASED ON FAR INFRARED FLUORESCENT LABEL Yi Cheng1, Dong Wang1, Mengxia Li1* (1Cancer Center, Daping Hospital and Research Institute of Surgery, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China ) [Abstract] Objective To establish the AP endonuclease activity assay based on far infrared fluorescent label. Method An abasic site containing substrate labeled at 5’ end with far infrared fluorescent moiety (IR700) was synthesized. A comparative study was performed with conventional isotope radiolabeled substrate based assay to evaluate the reliability, sensitivity and feasibility. Results Fluorescent labeled assay resulted in almost the same quality image as the radiolabeled assay, whereas the experiment time reduced from 1 day to 2 hours. Conclusion Far infrared fluorescent labeled AP endonuclease assay is more sensitive, easy and radio-contamination free which is suitable for daily use in almost every molecular biology laboratory. [Keywords] APE1; AP endonuclease activity assay; far infrared fluorescent label Corresponding author: Li Mengxia, Tel: 86-23 E-mail: lee800265@ [通信作者] 李梦侠，电话：（023E-mail：lee800265@脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)是DNA碱基切除修复（base excision repair, BER）的核心修复酶，其活性直接决定了细胞BER的整体功能。现有的研究显示，APE1是一个多功能蛋白，主要功能有C端的脱嘌呤脱嘧啶（apurinic/apyrimidinic，AP）核酸内切酶和N端的氧化还原功能[1]。APE1在肿瘤组织的高表达与肺癌、肝癌、卵巢癌及骨肉瘤患者预后差呈正相关，提示其在肿瘤发生、发展中具有重要作用。进一步功能研究提示，APE1与肿瘤细胞耐药、血管形成、放疗耐受等重要的肿瘤生物学特征也密切相关，以APE1为抗癌靶点具有潜在研究价值[2-4]。AP核酸内切酶活性是APE1核心功能，也是哺乳动物细胞生存所必需的生物学活性。在肿瘤学研究中，AP核酸内切酶活性的测定对于分析肿瘤细胞DNA修复能力强弱，发现APE1抑制剂等都十分重要，是DNA修复研究的重要研究方法。目前AP