蛋白质药物分析2.pptVIP

*;一、蛋白质类药物的来源; 用现代生物技术手段,如基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程等技术制备生产的药物. ;我国生物技术药物研究状况;近年来SFDA批准的生物技术药物;重组人脑利肽 重组人血管内皮抑制素 重组人血小板生成素 重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物 重组人生长激素注射液 重组人血小板生成素 ;重组人5型腺病毒注射液（安柯瑞）、重组人p53腺病毒注射液（今又生） 重组人胰岛素、重组甘精胰岛素注射液、重组赖脯胰岛素注射液 重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体、 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、 ;尼妥珠单抗 碘131美妥昔单抗 基因工程乙肝疫苗 ;*;如何认识蛋白质类药物纯度检测？;3. 只用一种方法作为纯度试验的标准是很不可靠的，必须选择多种测定纯度的方法。 最好的纯度标准是建立多种分析方法，从等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度来证明了蛋白质样品的均一性。; 4 纯度最终取决于所用方法的类型和分辨力，低分辨率方法检测合格的样品改用高分辨力方法时就有可能证明它是不纯的。 5 没有一个真正的检验纯度的方法，只有检测样品不纯或非均一的方法。 ;*;1.1 HPLC法(分子筛层析、反相HPLC、离子交换层析等);1.2.1 非还原SDS电泳法; 毛细管电泳的方法简便、快速，灵敏度和分辨率高，但价格昂贵，重现性差，尚未作为常规检定。;用于研究蛋白质纯度的方法和机制;几种检定重组蛋白纯度方法的比较;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*; 具有准确、快速，重复性好，测定范围广等特点，当相对分子质量小于10 000的蛋白质用上述方法因误差太大而无法测定其相对分子质量时，可用该法进行蛋白质相对分子质量的确认实验如重组人EGF、重组人bFGF和重组水蛭素等。;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*; 灵敏范围:0.2～2mg／m1；微管中最低可检出0.1m1(0. 05mg)。 需要的时间：几分钟。方法简单，样品可回收，但结果受光吸收物质影响。 适合于含有共轭双键较多的芳香族氨基酸的蛋白质含量测定。; 该测定方法简单、灵敏、快速，在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用，特别是在柱层析分离中，利用280nm进行紫外检测来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。如重组尿激酶原(Pro-UK)的质量检测标准中的蛋白含量测定项目就采用此法完成。 优点：快速，非破坏性，直接测定不需要标准品，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。 缺点①如果一种蛋白不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，它将无法检测；②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。 ;*;*;*; 为特异蛋白含量测定方法，具有特异性强，灵敏度高，同时测定样品多等特点，可用于生产过程中目标蛋白含量的测定。; 具有定量精确，灵敏度高，重复性好，自动化程度高等特点。 需要同种蛋白做标准品。; 结合Lowry法等总蛋白含量的测定，可用于复杂的蛋白混合物中目标蛋白的定量测定。 ; 重组制品原液蛋白量少，纯度高，可用Lowry法或Bradford法测定蛋白含量。 细胞因子蛋白含量正逐步采用HPLC法，HPLC法测定蛋白含量能够排除溶剂系统的干扰，特别适用于进行批与批之间的质量控制。 ;检测方法 微量的生物大分子:酶联免疫学或类似的方法进行定量或限量分析 小分子物质:液相色谱,气相色谱等分析化学方法或敏感的生物学方法。 具有自我复制、繁殖能力的病毒、支原体:生物学、分子生物学、生物化学和免疫学等方法 检测方法进行方法学验证 建立标准化的操作程序;蛋白质常用的定量方法的比较;*;*;*;*;*;*;*;*;单向纸层析;双向纸层析;*;*;*;高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）;*;*;*;*;*;*;*;*; 5.1 N末端和C末端氨基酸测序 作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要求至少测定N端15个氨基酸。 在中试头三批产品应当测定；C端定1～3个，但在我国现有法规中C端不一定要测定。 ; 二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关。测定巯基的方法有PMCB法、DTNB法和NEMI法等。对二硫键的分析虽然在常检定项目中没有规定，但在质量研究中应尽可能分析清楚。