应用酵母双杂交方法筛选与CVB33C蛋白相互作用人心脏细胞蛋白.pdfVIP

摘要 摘 要 目的： 筛选出与 CVB3 3C 蛋白发生相互作用的人心脏细胞蛋白，并对阳性 cDNA 克隆进行分析和鉴定，为进一步探讨CVB3 的致病机制奠定基础。 方法： 1、构建pGBKT7-3C 诱饵质粒：提取CVB3 感染的HeLa 细胞的总mRNA ， 逆转录为cDNA ，PCR 扩增3C 基因片段，用EcoR I 和BamH I 双酶切后，克 隆于载体pGBKT7 中，酶切鉴定进行DNA 测序验证； 2 、检测诱饵质粒pGBKT7-3C 在 AH109 酵母菌中表达与对报告基因的自 激活：验证 AH109 表型，将诱饵质粒 pGBKT7-3C 用乙酸锂法转化至 AH 109 中，挑取含pGBKT7-3C 重组质粒的阳性克隆接种选择性培养平板，进行表型 的鉴定，PCR 验证阳性酵母菌，Western Blot 方法检测融合蛋白表达，最后检测 DNA-BD-c-Myc-3C 融合蛋白对报告基因的转录自激活； 3、从人心脏cDNA 文库中筛选与CVB3-3C 蛋白有相互作用的阳性候选克 隆：采用大规模酵母配合法，将诱饵菌AH109[pGBKT7-3C]和人心脏cDNA 文 库的培养物 Y187[pGADT7-cDNA Library]相互配合，配合后接种于 SD/-Trp/- Leu/-His/-Ade 平板，30 ℃倒置培养21 d ，筛选表达报告基因HIS3 和ADE2 的 克隆； 4 、阳性克隆的验证和分析：将阳性克隆再转种于 SD/–Ade/–His/–Leu/– Trp/X-a-Gal 平板，确保阳性克隆表型正确（能同时表达3 种报告基因：HIS3 、 ADE2 和MEL1 ）；将pGADT7-ADx 质粒电击转化至大肠杆菌，扩增后提取质 粒送测序。测序结果的同源性分析通过 NCBI 网站的 BLAST 程序比对完成 （/BLAST/Blast.cgi ）。 结果： 1、成功构建pGBKT7-3C 诱饵质粒，经限制性内切酶酶切和测序序列分析 表明 3C 巳成功插入pGBKT7 载体的多克隆位点，其基因序列与 CVB3m 株 （GI:323432 ）3C 基因序列完全一致； 2 、表型鉴定和PCR 法均证实pGBKT7-3C 质粒成功转入酵母菌，Western II 万方数据 摘要 blot 证实AHl09 能表达3C 蛋白；缺陷型培养基和酶底物X-α-Gal 反应结果显示 3C 蛋白对报告基因无转录自激活作用； 3、以CVB3 3C 为诱饵蛋白，从人心脏cDNA 文库中筛选到18 个阳性候选 克隆； 4 、18 个阳性候选克隆表型均正确（能同时表达3 种报告基因：HIS3 、ADE2 和MEL1 ）；经测序和同源性比对，共获得2 种不同类别的阳性蛋白：心肌肌球 蛋白结合蛋白C （MYBPC3 ）和肌间蛋白3 （MYOM3 ）； 结论： 1、成功构建pGBKT7-3C 诱饵质粒； 2 、成功从人心脏cDNA 文库中获得2 种不同阳性蛋白: 心肌肌球蛋白结合 蛋白C （MYBPC3 ）和肌间蛋白3 （MYOM3 ），为研究CVB3 引起心肌炎和心 肌病的分子致病机制提供了新方向。 关键词：柯萨奇病毒；3C ；酵母双杂交系统；质粒构建 国家自然科学基金资助项目（No.