微生物的培养,纯化与观察.docxVIP

山东大学实验报告科目：微生物生物学题目：微生物的培养与观察时间：2016年9月18日—2016年9月23日实验目的证实实验环境和人体表面存在微生物，体会无菌操作的重要性。学习和掌握培养基的配置原理和方法，能够熟练配置各类培养基。了解干热灭菌、高压蒸汽灭菌的原理，熟练掌握灭菌的操作。掌握倒平板的方法和几种常用的分离和纯化微生物的基本操作技术，特别是平板划线法。学会观察和描述各种微生物的菌落形态特征，并学会菌落计数的原理和方法。掌握一些微生物实验的基本操作技能，如包扎各种仪器，制作棉塞，纸绳子的打结方法等。实验原理1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基要选择合适的配比关系；选择合适的理化性质；配后要及时灭菌。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。其中牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而氯化钠主要提供无机盐。培养基配置好后，用稀酸或稀碱将其pH调至所需的要求。在配制固体培养基时还需要一定量的琼脂作凝固剂。2.高压蒸汽灭菌的原理水的沸点可随压力的增加而提高，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，因锅是密闭的，蒸汽不能溢出，而使压力增加，水的沸点和温度也随之增加。因此，高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温，以及热蒸汽的穿透能力来达到灭菌的目的。一般在0.1Mpa（15lb/in2）的压力时，温度可达121℃只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。3.平板划线法的原理 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。 平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。由此可知，这4个区的面积安排应做到DCBA。仪器用品仪器：培养皿若干、500ml三角烧瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、棉塞、精密试纸、牛皮纸、橡皮筋、记号笔、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、火柴、试管三只、棉签、标签纸、接种环、称量纸、恒温培养箱等药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、蒸馏水、稀盐酸、稀NaOH溶液、自来水等实验步骤培养基的制备计算：根据配方，计算出所需的各种物质的用量，分别是牛肉膏0.9g、蛋白胨3g、氯化钠1.5g、琼脂粉6g、蒸馏水300ml.称量：按照计算的用量称取药品，每种物质都要在称量纸上称取，其中牛肉膏需要用玻璃棒挑取。溶解：在干净的烧杯中加入蒸馏水300ml，将琼脂粉以外的其他物质加入，牛肉膏同称量纸一并加入，静置等牛肉膏与称量纸脱离后用玻璃棒挑出称量纸，然后搅拌至完全溶解。调pH：用稀酸或稀碱调节pH为7.0～7.2，然后将溶液转移到三角烧瓶中，加入琼脂，摇匀。加塞包扎：选取合适大小的棉塞塞紧瓶口，用八分之一大小的牛皮纸包住瓶口，并用橡皮筋系紧，做好标记，准备灭菌。高压蒸汽灭菌将培养皿按十个一组用二分之一大小的牛皮纸包好，然后再用四分之一大小的牛皮纸包好五个，用皮筋系紧，做好标记准备灭菌。取三只试管，分别加入少量的蒸馏水，加上棉塞，用合适大小的牛皮纸一起包好，系紧，标记灭菌。打开高压蒸汽灭菌锅，加入合适量的水，将要灭菌的物品整齐放入灭菌锅内，其中试管可夹在培养皿缝隙中，放好后盖上盖开始灭菌。当压力达到0.1MPa时，灭菌二十分钟（各项数值提前在灭菌锅上调好）。待机器发出警报后，关闭电源。等压力降到零后，打开盖子，取出物品。倒平板操作取出培养基后轻轻摇动，使其均匀，将培养皿皿底朝上放置，等待期温度下降。点燃酒精灯，等到培养基不烫手后，开始倒平板，一次用左手摸取一个培养皿，用右手手掌托住三角烧瓶，在酒精灯附近打开三角烧瓶，在火焰上烧一下棉塞和瓶口。半开皿盖，倒入液体使其没过皿底，合上盖子。在桌子边沿