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上游顺式作用元件的研究方法 mega 顺式作用元件（Cis-acting elements） 指同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列，即具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其他调控基序。 顺式作用元件能够被特异转录因子识别和结合，从而影响基因表达活性。 顺式作用元件的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质, 仅仅提供一个作用位点, 要与反式作用因子相互作用而起作用。 按功能特性分为 通用调节元件：启动子、增强子、沉默子和绝缘子 专一性元件：应答元件，如激素应答元件等 启动子(Promoter) 概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。包括核心启动子和上游启动子元件。 一个基因可同时拥有一个及以上启动子； 一般在转录起始点上游，位于5‘端上游100-200bp左右，是决定转录起始点及转录频率的关键元素； 可与增强子共同控制转录起始和强度； 发挥功能时需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用。 由两部分组成： 核心启动子（CPE)：指保证RNApolⅡ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25—-30 bp的TATA盒。它单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录； 上游启动子元件（UPE)：包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC盒等，能通过TFⅡD复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。 增强子(enhancer) 指能够提高转录效率、远距离调控基因转录的上游DNA序列,它间接的把信号从激活因子传到转录蛋白。 特点： （1）它能通过启动子大幅度地增加同一条DNA链上靶基因转录的频率，一般能增加 10～200倍，有的甚至可达千倍。 （2）增强子的作用对同源或异源的基因同样有效，如把SV40的增强子连接到兔β-珠蛋白的基因上，可使转录强度增大100倍； （3）增强子的位置可在基因5’上游、基因内或其3’下游的序列中，增强效益与其位置和取向无关； （4）增强子所含核苷酸序列大多为重复序列，其内部含有的核心序列，对于它进入到另一宿主之后重新产生增强子效应至关重要； （5）增强子一般都具有组织和细胞特异性； （6）增强子在DNA双链中没有5’与3’固定的方向性； （7）增强子可远离转录起始点，通常在 1～4 kb（个别情况可达30 kb）外起作用； （8）增强子的活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关。另外，许多增强子还受到外部信号的调控，如金属硫蛋白基因的增强子就可对环境中的锌、镉浓度作出反应。 从机能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。 有时，对结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。通常描述的、具有独立的转录活性和决定基因时间、空间特异性表达能力的启动子就是这类定义的启动子。 沉默子(silencer) 是可以抑制基因表达的顺式元件,包括沉默子元件和负调控因子(NRE),分别指导主动和被动抑制作用。 特点： 负性调节元件，与增强子作用相反 不受序列方向影响，同时也能远距离发挥作用 本身不能实现衰减作用，必须通过对前导序列的翻译才能实现，衰减作用的实质是以翻译手段控制基因的转录。 绝缘子（Insulator） 一种负调控元件，参与基因表达的负调控。干扰增强子与启动子的相互作用，并抑制启动子的激活活性。 应答元件 另一类位于基因上游能被转录因子识别和结合,调控基因专一性表达的DNA序列。如热激应答元件、激素应答元件, cAMP应答元件等。 应答元件含有短重复序列,不同基因中应答元件的拷贝数相近。 蛋白因子结合在应答元件的保守序列上,通常位于转录起点上游200bp内； 应答元件也有位于启动子或增强子内。 研究顺式作用元件结构的方法 ①5’端缺失系列分析法 通过从一侧逐段缺失来确定启动子的边界. 当一段缺失不会阻碍RNA合成, 而下一段缺失使转录不再发生时, 那么我们可以确定启动子的边界必然存在于两者之间. 常用于测定哺乳动物基因调控区的上游边界。 爪蟾5SrRNA基因的Ⅲ类启动子分析 实验操作：首先，确定启动子的5’端。对爪蟾5SrRNA基因的5’端序列进行逐渐缺失，每次缺失序列的长度都会增长，有此获得5’端长度不等的系列5SrRNA基因突变体，体外观察突变对基因转