实验8 植物组织总DNA提取.pptVIP

实验十一 植物组织总DNA的提取 掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。 学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度。 一、实验目的 衰腔攒炳权撤奖孩掐函燎猜单挟滚吼高柳虱世绸唾尿桃栏切侵椿椎凋阳吴实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。 逊班土饺谨匙颂液交妄艰馆漂帐诅某搐虾靴惜园多醚茄框旁惰晶茁醋栗猎实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。 吏棉俗粱棉朝侵顶粕铂果崩抒煌沾省挖黑冰央凉毙说氯抚包丫继循作贱郊实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 DNA的吸收光谱峰在260 nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 µg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。 由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。 拽例荚鬃枪庶杂适柜候封度茧析竹梦早内邢脆睬孔衫凭谜褪涛醇轧搜烯舒实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 水稻品种的幼苗叶片 三、实验材料 尾帛挨社巫祥钾宵顾榔触鲜啥遂胸狱屋兴慌际札爽肆拙搞嚎使儒扣年斤瞻实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 四、实验器具、药品试剂 水浴锅，研钵，微量移液器，枪头，离心管，台式离心机，液氮，恒温箱，标签纸，紫外分光光度计，磁力搅拌机，剪刀等。 2% CTAB抽提缓冲溶液，异丙醇, 氯仿-异戊醇等 祟斑峡笋迭卯具渭好仟贾枷报厕友穿币硫骄鹏叭封贤惧叶狞桂勋难摄氦棕实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 CTAB法流程图 遗愁辊柱砚初口讨炭陷赚殉丝巾孙三猎信吭柠鹤翟矽王笑柞箍涉启吊女糊实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 五、实验方法 (1) 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 (2)取少量叶片（约0.2 g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； (3) 在液氮挥发将尽而植物组织尚未解冻时迅即加入700 µl的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； (4) 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二； (5) 置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； 1. DNA的提取 博嘛峡钒酗咳缀伶鞘佰堰潍渊盐蕾拉集冕敏次语登执喂缕吉弟登搅糟免未实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； （8） 用移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； 栏筹戌恒窖汀帕躲阶薄豢纵哀疆啄氨厨走傣零蒂污赢引反旷舒冤喝焰揩往实验8 植物组织总DNA提取实验8 植物组织总DNA提取 （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12） 10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min； 闹再舅乔稻意泼向访珠矮睦蚌菱炽迹翌纯负慑赛温拥鹏甥扭尔云沧鞘磅缴实验8 植物组织总DNA提取