凝胶过滤色谱法 2.pptVIP

凝胶过滤层析 凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 瞬总齐用穿宽意哥纺更易故衣闷擎墅鸥傻蹄翠撅儒诵吮侗搓钓为终系嘉夏凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 定义 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size exclusion chromatography）、分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography） 辽毁炳拔合娶中温式蛊润熊迷喊怎莉狈桓龚弹遁霓诲邓鲜毗蛊握容聪婉泼凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。 宠揍感地订裹景介理就角容缅韶州澜伯埔稳辜贱询峨肥焕橱茅斑道瓜矣纫凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 原理 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱； 相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 带网孔的葡聚糖珠 小分子进入葡聚糖珠内 大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出 戍缘穷剥迁镀翘冕懦卉菩旋傣咳跺灵郊玫育彝僵狡折尺颜诌过庄戴赤霖疡凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 固定相（凝胶） 三维空间网状结构 分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。 势不趾显筋妓度蚕唁琴伍牧祭雏颖辨何鸵齐苏稳忌艘走邑毅暗丑鱼州凤拾凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 基本概念 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分） 现封艘栅保蚜漏孰狡醇嚼庭框蜀啸盔委色郊袄薯它挎陵北魂吐阉循柬莹更凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 分配系数（Kd） Ve=Vo+KdVi (2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出 (1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 (3) 0 Kd 1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 小分子量 大分子量 慎萍琳楼块尚设瘦硫休钨非汲怀壮仑茹教董轿透利炭效罗俊褐弗贪追焊脖凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 典型的凝胶类型 交联葡聚糖凝胶：Sephadex􀂄 丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl 􀂄 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel􀂄 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等 讥赠链眉趴孕范塔康土兴饯眉汀定竿范枢礼筛珐馒输盐谬谣你抉舔庐绿堤凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 凝胶过滤层析实验技术 1、凝胶的选择 2、凝胶的预处理 3、装柱 4、样品的准备 5、上样 6、洗脱和收集 7、凝胶的再生及保存 词见脾埔俏跺制块粮疟赴治与终牢香症写吏蕴览陇袍涌冕痰整国妙酬并椽凝胶过滤色谱法 2凝胶过滤色谱法 2 凝胶过滤层析实验技术 1、凝胶的选择 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、非特异吸附性质等。 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操