直接计数法(血球计数器).DOC

直接計數法(血球計數器) 原理 總菌數測定是計算微生物數量的直接方法，可分為直接計數及間接計數兩類。其中直接計數是利用不同的計數器或載玻片在顯微鏡下直接觀察，計算微生物細胞的總數量。此方法優點為方便、快速、節省時間；缺點為無法辨識是否為微生物或是玻片上的黑影，部份微生物未能沉降或死亡狀態，以肉眼觀察計數的誤差極大。直接計數目的為計數並非觀察，所以只需能辨別出菌體即可。 ＜血球計數法＞ 血球計數器為直接計數法中最常用的方法，計數器上凹槽有一邊長1mm的正方形格子，該格內分為25個大方格(5*5)，每一大方格再細分為16個小方格(4*4)，因此每小方格的邊長為0.05mm。在高度方面，蓋上蓋玻片後，玻片與計數器的間距恰好為0.1mm，故每小格的體積等於0.00025mm三次方。實驗時滴入菌液蓋上蓋玻片(22mm*22mm)，使菌液充滿計數器凹槽中，接著以顯微鏡觀察計算小方格內菌體數量，即可求得單位體積樣品之總菌數。 設備 器材 : 拭鏡紙、蓋玻片、玻璃(塑膠)滴管、燒杯(盛裝待測菌液)、玻璃試管。 儀器 : 光學顯微鏡、血球計數器。 菌種或採樣來源 市售酵母粉 步驟 取0.5g酵母粉加入50ml培養液稀釋，以玻棒攪拌，充分振 盪混合。 取10ml菌液加入第一支試管，再以十倍去稀釋，取1ml菌液 加入9ml的培養液，以此類推，共5支不同濃度的菌液。 測吸光值，先以培養液裝入比色管8分滿，進行校正歸零，再將5支不同濃度的菌液裝入比色管測吸光值(從濃度低至濃度高做)。 吸光值須界於2~0.01之間，濃度太高或太低則捨棄不用。 使用血球計數器計算菌液，以滴管吸取一滴菌液，滴於血球 計數器上凹槽處，並蓋上蓋玻片。 用顯微鏡放大檢視，隨機選取一個大方格進行計數，即計算大方格中的16個小方格微生物總數。總共計算十個大方格，求其平均值。 五、實驗結果 濃度吸光值菌數平均數量Log10-10.322273816176632.87.1110-20.112953112093600005.5510-30.084005311.872003.8510-40.066050300.6241.3810-50.0570010201010-60.0420030100-1.0010-70.0400001000-2.00問題與討論 1、說明以直接計數法進行微生物計數之原理與優缺點為何？ A: 優點為方便、快速、節省時間；缺點為無法辨識是否為微生物或是玻片上的黑影，部份微生物未能沉降或死亡狀態，以肉眼觀察計數的誤差極大。直接計數目的為計數並非觀察，所以只需能辨別出菌體即可。 ２、計數時若小格格線上有微生物，為何不計每小格線左方和上方兩線上之微生物，僅計每小格線右方和下方兩線上之細胞？ A:避免重複計數。 ３、由實驗過程說明此一計數方法可能產生實驗誤差的原因何在？如何減少誤差？ A: 菌體尚未完成沈澱、菌液抹片不均勻、肉眼數菌誤差、顯微鏡與玻片可能有其它雜質污染。每一方格應重覆數次求總平均值，並計算其微生物數量。 ４、說明如何以血球計數法直接計算微生物樣品之總菌數。 A: 血球計數器為直接計數法中最常用的方法，計數器上凹槽有一邊長1mm的正方形格子，該格內分為25個大方格(5*5)，每一大方格再細分為16個小方格(4*4)，因此每小方格的邊長為0.05mm。在高度方面，蓋上蓋玻片後，玻片與計數器的間距恰好為0.1mm，故每小格的體積等於0.00025mm三次方。實驗時滴入菌液蓋上蓋玻片(22mm*22mm)，使菌液充滿計數器凹槽中，接著以顯微鏡觀察計算小方格內菌體數量，即可求得單位體積樣品之總菌數。 ５、說明如何以血球計數法直接計算微生物樣品之總菌數。 血球計數器為直接計數法中最常用的方法，計數器上凹槽有一邊長1mm的正方形格子，該格內分為25個大方格(5*5)，每一大方格再細分為16個小方格(4*4)，因此每小方格的邊長為0.05mm。在高度方面，蓋上蓋玻片後，玻片與計數器的間距恰好為0.1mm，故每小格的體積等於0.00025mm三次方。實驗時滴入菌液蓋上蓋玻片(22mm*22mm)，使菌液充滿計數器凹槽中，接著以顯微鏡觀察計算小方格內菌體數量，即可求得單位體積樣品之總菌數。 心得 信瑋：這次實驗又再次用到顯微鏡，但有很大的不一樣，叫做血球計數器，而使用的方法真的要必須慎重，先經由老師教導後知道如何使用，並且開始觀察動作，觀察過程得相當仔細細心，才可能觀察的到所有的菌數，但因為那些菌數幾乎小到有點看不太到，所以觀察完後眼睛真