硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞复制性老化的作用 .docVIP

　　硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞复制性老化的作用 【摘要】 目的：对体外传代培养出现复制性老化的大鼠软骨细胞进行硫酸氨基葡萄糖干预实验，观察硫酸氨基葡萄糖对软骨细胞复制性老化的影响。方法：将第3代软骨细胞分为空白对照组、硫酸氨基葡萄糖不同浓度组，传代使细胞进入第4代，同时以第2代软骨细胞为青年对照组，进行组化检测老化相关β-半乳糖苷酶、流式细胞仪分析细胞周期和增殖指数、阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸GAG(glycosaminoglycan)含量和结构、RT-PCR(reverese transcript-polymerase chain reaction)检测Ⅱ型胶原及Aggrecan蛋白，并对硫酸氨基葡萄糖抗软骨细胞老化进行分子生物学研究。结果：硫酸氨基葡萄糖显著抑制老化相关β-半乳糖苷酶的表达(P0.01)，促进鼠软骨细胞增殖，减少G1期细胞含量，促进软骨细胞胞外基质GAG、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白表达(P0.01)。结论：硫酸氨基葡萄糖具有显著的抗软骨细胞复制性老化作用。 【关键词】 硫酸氨基葡萄糖；大鼠；软骨细胞；老化 Abstract Objective: To observe the effect of glucosamin sulphate (GS) on replicative senescence of rat chondrocyte subcultivated in vitro by means of GS interfering and controlled experiment. Methods: The 3rd passage chondrocytes ethod of histochemistry for S-A-β-gal, for cell life cycle and proliferation index etry, for the content and constructure of GAG of ECM olecular biology study ote chontrocytes proliferating(P0.01), reduce cell content in G1 phase, increase content of GAG, and enchance the expression of type Ⅱcollagen and Aggrecan of ECM (P0.01). Conclusion: GS can significantly oppose rat chondrocyte senescence occurred in subcultivation. Key in sulphat(GS); Rat; Chondrocyte; Senenscence 软骨细胞属于终末分化细胞，其在体外的传代培养过程中细胞停滞于细胞周期的G1期，增殖能力减弱，表型丧失，呈老化状态，这种老化属于复制性老化（replicative senescence）。有实验研究显示，软骨细胞体外传代培养出现复制性老化发生在P4代[1-2]，本研究的细胞传代实验中也发现大鼠软骨细胞在P4代出现老化改变[3]。硫酸氨基葡萄糖（GS）是关节软骨生物合成和刺激合成聚氨基葡萄糖及透明质酸骨架的基本物质，被认为是第一个改变骨关节炎病情的药物。本实验拟考察其对软骨细胞复制性老化的作用，进而为优化组织工程软骨细胞，为其防治骨性关节炎提供实验支持。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 清洁级SD大鼠（福建医科大学实验动物中心提供，闽验证合格证号2005C03）共8只，4周龄，雄性，体重180～200g。 1.1.2 主要试剂 αMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清FBS（HyClone公司）；胰蛋白酶Trypsin 1∶250(Amersco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、PBS(Gibco公司)；二甲基亚砜DMSO(Amersco公司)；盐酸胍(GnCl)、Alcian blue和TritonX－l00（上海生工公司）；β-半乳糖苷(X-Gal)（厦门泰京公司）；TRIZOL、RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)；PCR引物（上海生物工程有限公司）：typeⅡcollagen：上游5- TGGTGCTGCTGACGCTGCTCATCGCCACGGTCCTA-3，下游5-GCCTTCTGATCAAATCCTCCAGCCATCTGGGCCGC-3(340bp)；Aggrecan：上游5-CTGCTACACAGGTGAAGACTTTGTAGACATCC-3，下游5-TGCTGTGCCTCCTCAAATGTCAGAGAGTATCT-3（475