重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备论文.docVIP

　　重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备论文 张琦，卢改娜，谢旦立，甄伟春，楼永良 【摘要】 目的?：制备重组创伤弧菌溶细胞素(rebinant Vibrio vulnificus cytolysin，rVVC)鼠源性单克隆抗体，并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定，为创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin.freelonoclonal antibody against rebinant Vibrio vulnificus cytolysin (rVVC) munoglobulin ent of rapid detection kit of Vibrio vulnificus cytolysin. Methods:?IPTG mune BALB/c. The effects of expression and purification of rVVC ined by SDS. The hybridoma cell lines to secrete anti-rVVC monoclonal antibodies a technique and ELISA，and then ited dilution. Double immunodiffusion assay onoclonal antibody. ELISA and double immunodiffusion assay ine the specificity. Results:?The mice immunized by rVVC dilution to 1:12?800 by ELISA. Ta onoclonal antibodies. The monoclonal antibodies sho other bacteria. Conclusion:?BALB/c mice is successfully immunized and touse-origin hybridoma cell lines named B2C7 and E3F4 onoclonal antibodies against rVVC are acquired. The type of monoclonal antibody against rVVC is IgG1. Key a;monoclonal antibody 创伤弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌，主要存在于海水及海产品中，可引起原发性败血症和严重的创口感染1-2。近几年，浙江沿海、深圳也时有报道该菌感染病例，已引起很多专家学者关注。创伤弧菌可能包含诸多毒力因子3，溶细胞素是其唯一分泌至胞外具有种特异性的膜成孔类外毒素4，可作用于多种靶细胞诱导细胞凋亡、坏死，引起细胞炎症反应等5-6。此外，体外重组的创伤弧菌溶细胞素(rebinant Vibrio vulnificus cytolysin，rVVC)亦具有典型的细胞毒活性，能引起人ECV304细胞凋亡7，诱导人SMMC7721细胞产生细胞应激，上调其TNF-α和HSP90的表达8。目前，有关创伤弧菌溶细胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVC)抗体的研究较少，姚蔚等9曾利用体外rVVC制备了其多克隆抗体，并证实该多抗能阻断rVVC对SMMC7721的细胞毒作用，为保护性抗体。而单克隆抗体相比多克隆抗体，具有更高的特异性。因此，本研究中，我们采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化原核表达的rVVC，采用杂交瘤技术制备鼠源性rVVC单克隆抗体并进行免疫学鉴定，以期为VVC致病机制的深入研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素的快速检测试剂盒研发奠定基础。 1??材料和方法 1.1??材料 1.1.1??细胞系、菌种及质粒：小鼠骨髓瘤SP2/ 0细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。E.coli BL21(DE3)pET28a(+)-vvhA由本实验室构建完成及保存。 1.1.2??实验动物：清洁级雌性6周龄BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心(上海斯莱克实验动物有限公司)，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。 1.1.3??主要试剂：Ni2+-NTA亲和层析树脂购自上海申能博彩生物科技有限公司。异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)购自宝生物工程(大连)有限公司。还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、盐酸胍及精氨酸购自BBI公司。HRP标记羊抗小鼠IgG、TMB底物显色液购自天根生化科技(北京)有限公司。优级胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司。RPMI 1640购自Hyclone公司。PEG6000、HT和HAT培养基购自SIGM