重组结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定论文.docVIP

　　重组结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定论文 摘要 从H37Rv基因组中扩增Mr38 000 蛋白基因并高效表达和纯化。用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Mr 38 000蛋白序列，将其与pGEM-T-Easy 载体连接转化E.coli DH5α，构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/ Mr 38 000，测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α，IPTG诱导目的蛋白表达。 经r 38 000蛋白基因，测序结果与GeBank 中报道的完全一致。SDS显示， 在Mr为38.5×103处有相应的蛋白质表达条带.freel Mycobacterium tuberculosis ZHANG Ming， LI Jin-cheng， LIN Hang (Department of internal neurology, 2. emergency department, the Fu Zhou general hospital, Fu Zhou, 350025, P. R. China) Abstract To obtain Mycobacterium tuberculosis Mr 38 000 protein from H37Rv-DNA, express efficiently in E. coli and purify the Mr 38 000 proteins. Mr 38 000 protein gene plified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEM-T-Easy vector. After sequenced, Mr 38 000 protein gene e digestion, named pQE-80L-Mr 38 000. The plasmid pQE-80L-Mr 38 000 ed into E.coli DH5α and induced by IPTG. Mr 38 000 protein expression ed by ice-specific mAb against (His)6. Mr 38 000 protein gene olecule Ab. The expressed protein could be purified by Ni-NTA system kit tuberculosis (MTB) 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）是结核病(tuberculosis,.freel购自Promega公司；X-gal， 限制性内切酶BamHⅠ, EcoRⅠ及T4-DNA连接酶，TaqDNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；IPTG, DTT, DTE, 小量质粒提取试剂盒均为Sigma公司产品，胶回收试剂盒为Vitagene公司产品。 1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成 根据已发表的MTB H37Rv全基因组Mr 38 000 蛋白基因序列设计引物。上游引物P1: 5’-AGGGGATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3’，含BamHⅠ酶切位点和起始密码子， 下游引物P2:5’-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3’ 中加入EcoRⅠ酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。 1.2.2 Mr 38 000片段的扩增 取保存于改良罗氏培养基的MTB H37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2~3 L液体培养物的菌体沉淀重悬于50μL裂解液（10╳PCR绶冲液5μL, 45 g/L吐温， 5μL, 45 g/L, NP-40 5μL，20 g/L蛋白酶K 0.5μL及水34.5μL）中。于55℃水浴1 h，沸水浴10 min灭活蛋白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μL TE中， 作为DNA模板。PCR反应体系为：10╳buffer 5μL, dNTPs 5μL (2.5mmoL/L)、DNA模板为1μL，P1，P2 引物各1μL (25μmoL/L)及Taq酶1μL，加水至50μL。PCR条件：94℃变性40 s，60℃复性30 s，72℃延伸1.5 min， 30个循环。 1.2.3 PCR产物的克隆与鉴定 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带。取纯化的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy进行连接反应，转化感受态DH5α， 均匀涂布于含有x-gal (33μL) 和异丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG (20μL)的LB培养皿中，37℃培养16 h， 挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGE