重组胸腺素α1 的分离纯化和活性测定论文.docVIP

　　重组胸腺素α1 的分离纯化和活性测定论文 .freelosin alpha1，Tα1 ）. 方法 将高效表达融合蛋白的工程菌用细胞破碎器裂解，经80℃热处理，离心上清采用Q-Sepharose FF阴离子交换色谱纯化融合蛋白.融合蛋白经Br裂解后用常压离子交换色谱纯化Tα1 单体.应用SDS，2L-Tricine-SDS和HPLC进行鉴定. 结果 SDS分析表明菌体表达的融合蛋白占菌体总蛋白的400g kg-1 .经2L-Tricine-SDS分析证实，融合蛋白可裂解出Tα1 单体.freelosin alpha1;fusion expression;protein pu-rification;biological activity Abstract:AIM To purify and prepare thymosin alpha1（Tα1 ）.METHODS The engineering bacteria TOP10includ-ing rebinant plasmid of a fusion expression vector pThio-HisA Tα1 gene of4repeats（Tα1 ④）perature of80℃for10min-utes，and cooled quickly.By Q-Sepharose Fast Floatography，the fusion protein the super-natant of the lysate.At the concentrion of0.5mol L-1 Br cleavage of the fusion protein in700mL L-1 formic acid，Tα1 ethods of SP-Sepharose Fast Floethods and proved by2L-Tricine-SDSanalysis.HPLC shoilar biological activity to that of the synthesized Tα1 .They could increase the proliferative re-sponse of the mitogen ConA stimulated spleen lymphocytes.CONCLUSION Method is convenient and simple for purifi-cation and preparation of Tα1 in large scale. 0 引言 胸腺素α1 （thymosin alpha1，Tα1 ）是从胸腺素组分5（TF5）中分离纯化出的由28个氨基酸残基组成的酸性多肽，其Mr 为3108，pI4.2［1，2］ .在各种抗原或致有丝分裂原激活后，Tα1 能够增加T细胞IFN［3］ ，IL-2［4］ 和IL-3［5］ 等淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平;Tα1 还能影响NK前体细胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后变得更有细胞毒性［6，7］ ;在活体内Tα1 能增加ConA激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌IL-2并增加IL-2受体的表达作用［4，7］ ;配伍其他细胞因子具有抗肿瘤作用［8］ .Tα1 临床用途广泛，已应用于治疗乙肝［9］ 、丙肝［10］ 、癌症［8，11］ 及免疫缺陷［12］ 等疾病的研究中，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂. 目前国外化学合成的Tα1 已临床应用，但价格昂贵.我们利用硫氧还蛋白-Tα1 ④融合基因在E.coli中的表达，经简单的预处理和离子交换色谱，得到了纯度较高的融合蛋白，把融合蛋白进行裂解获得了高纯度的Tα 1 单体，且具有较高的生物活性.该研究旨在寻找简便易行、经济有效地纯化和生产Tα1 的技术方案，为今后的大批量生产奠定切实可行的工艺流程基础. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌体的获得 重组质粒pThioHisA-Tα1 ④由本中心构建，由重组质粒pThioHisA-Tα1 ④转化E.coli TOP10［基因型为FˉmcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC）Φ80lacZΔM15ΔlacX74deoRrecAlaraD139Δ（ara-leu）7697galU galKrpsLendAlnupG］.挑单克隆接种于5mL LB培养液，37℃振荡培养至A600nm 为0.6，按50mL L-1 接种于新鲜LB培养液中，37℃振荡培养到A600nm 为0.5，加IPTG至终浓度为1mmol L-1 ，37℃继续培养4h，离心收集菌体. 1.1.2 生化试剂 SP-Sepharose FF，DEAE-Seph-arose FF和