骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性神经炎的研究论文.docVIP

　　骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性神经炎的研究论文 .freelental autoimmune neuritis by bone marroal cells Abstract AIM: To investigate the therapeutic effect of bone marroal cells (BMSCs) transplantation on experimental autoimmune neuritis (EAN) and study the possible mechanism. METHODS: EAN model munizing Learked e PKH26 and injected into the rats’ caudal vein 10 d after immunization. The therapeutic effect of BMSC transplantation on EAN rats ent, immunohistochemical staining, and ELISA, respectively. RESULTS: The injected BMSCs could migrate to the demyelinated nerve tissues,.freelyelination and inflammatory infiltration phocytes ental autoimmune neuritis, EAN）的疗效以及相应的作用机制。方法: 用P0180199多肽与弗氏完全佐剂的混合液免疫Lee, GBS）, 是临床上最常见的急性瘫痪性疾病, 具有较高的致残率和病死率1, 目前尚未有针对此病特异有效的治疗手段。GBS已经被公为是由CD4+ T细胞介导的自身免疫性疾病, 细胞因子通过改变Th1/Th2型细胞之间的平衡, 主要是增强Th1型细胞的作用, 在疾病损伤中发挥重要作用2。骨髓基质干细胞（bone marro cell, BMSC）, 具有很强的自我更新的能力和分化潜能。体内外实验中已发现, BMSC在不同的诱导环境中可分化成不同细胞, 并具有修复各种组织缺损的能力3。本实验中利用GBS的动物模型实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis, EAN）为研究对象, 探讨了BMSC移植治疗EAN的疗效以及相应的作用机制, 证实BMSC可通过修补损伤的周围神经髓鞘, 影响Th1/Th2型细胞之间的平衡而发挥作用, 为应用BMSC治疗GBS提供了实验依据。 1 材料和方法 1.1 材料 LeAb）购自武汉博士德生物工程有限公司。小鼠抗大鼠CD4、 CD8 mAb购自BioLegend 公司。ED1 抗大鼠巨噬细胞抗体购自Serotec公司。HRP羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司。 1.2 方法 1.2.1 EAN动物模型的建立 Lein。取沉积的细胞计数, 每1×107个细胞加入0.5 mL Diluent C重悬后, 加入0.5 mL 4×10-6 mol/L PKH26染料, 室温轻柔混合2～5 min。加入等体积的小牛血清1 mL终止反应, 再加入等体积的DMEM培养液 2 mL稀释。室温下用DMEM培养液洗3次, 以400 g离心10 min, 加DMEM培养液重悬。 1.2.3 BMSC 的回输 于免疫后的第10天, 治疗组的每只鼠尾静脉回输0.5～0.6 mL PKH26标记的BMSC悬液（含2×106个细胞）。 1.2.4 细胞因子的检测 于免疫后第16天发病高峰时心脏取血, 离心后取血清作1∶2稀释。同时取淋巴结制成淋巴细胞悬液, 加入P0180199（10 mg/L）抗原刺激3 d。将淋巴细胞的培养上清作1∶10稀释, 用ELISA法检测血清和培养上清中IFNγ、 TNFα及IL4的水平。参照ELISA试剂盒说明书, 除空白孔外, 分别将不同浓度的标准品、 待测样品加入相应的孔中, 每个样品设3个复孔, 于37℃孵育90 min。加入生物素化的抗大鼠IFNγ、 TNFα、 IL4, 37℃孵育60 min。加入酶结合物于37℃孵箱孵育30 min。避光于37℃、 OPD显色剂15 min, 终止后测定A450值。 1.2.5 T细胞和巨噬细胞的免疫细胞化学染色检测 于发病高峰分离出靠近脊髓腰段的坐骨神经, 作冷冻组织切片（4~6 μm）。以冷丙酮固定20 min, 加预冷的30 mL/L H2O2去离子水溶液灭活内源性过氧化物酶15 min, 加1 mL/L Triton X100溶液通透组织20 min, 再加50 mL/L马血清室温封闭组织1 h。滴加小鼠抗大鼠CD4 mAb 7