上海交通大学微生物实验课件实验二原核微生物的染色及观察.pptVIP

实验二 细菌染色及形态观察 目的要求 p76、81 掌握无菌操作技术 学习微生物涂片、染色的基本技术 掌握革兰氏染色法 了解革兰氏染色的原理及在细菌分类鉴定中的重要性 掌握芽孢染色法，了解芽孢杆菌的形态特征 巩固显微镜操作技术 无菌操作过程 革兰氏染色法 是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结力。 革兰氏染色法基本原理 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 革兰氏染色步骤 涂片：载玻片中心加水一滴，无菌操作挑菌，混于水中，涂开（大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌/金黄色葡萄球菌或大肠杆菌/枯草芽孢菌） 干燥，固定：玻片在酒精灯上加热 初染剂结晶紫进行染色：结晶紫液1分钟－水洗 碘液媒染：再加碘液1分钟 然后用乙醇脱色：滴洗至玻片下端刚不显紫色止－水洗 最后用复染剂(如番红)复染：番红染液1分钟－水洗－吸干－显微镜观察。 经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。 细菌的芽孢染色法 芽孢又叫内生孢子(endospore)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。 细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 芽孢染色法基本原理 由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，用着色力强的染色剂孔雀绿在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。 操作步骤 制备菌悬液:小试管中加1－2滴水,挑取2－3环菌苔,混匀制成菌悬液 染色:加2－3滴孔雀绿染液与菌液混匀,置于沸水浴中加热15－20min 涂片固定:接种环取菌液于玻片上涂成薄膜通过火焰3次温热固定 水洗: 复染:番红染液染3min,倾去染液,水洗，吸干 镜检:油镜观察 染色的内容 大肠杆菌单染 金黄色葡萄球菌或枯草芽孢菌单染 大肠杆菌/金黄色葡萄球菌或枯草芽孢菌混合染色 决定染色的关键步骤 新鲜培养的细菌 涂片均匀 脱色 作业 1、绘革兰氏染色的3个结果(大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌/金黄色葡萄球菌或大肠杆菌/枯草芽孢菌) 2、绘芽孢染色结果 3、思考题: P80思考题：1和3 p84思考题：1－3