人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用 - 生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（２）：５４５９ 人ＤＦＦ４５蛋白多克隆抗体制备及其初步应用 孔卫青　李海芳　刘　涛　吴海东　强　冉　汤石明　刘　民　汤　华 （天津市生命科学中心实验室 天津医科大学基础医学院　天津　３０００７０） 摘要　目的：表达、纯化带ＧＳＴ标签的ＤＮＡ裂解因子４５（ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ４５，ＤＦＦ４５）融 合蛋白并制备多克隆抗体。方法：构建ｐＧＥＸ５Ｘ１／ＤＦＦ４５原核表达质粒，转化大肠杆菌ＢＬ２１，用 ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达，经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用 ＣＮＢｒａｃｔｉｖａｔｅｄ ＴＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ进行纯化。用间接ＥＬＩＳＡ法检测抗体效价，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定抗体特异性，同时用 免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察ＤＦＦ４５的细胞定位。进一步检测ＤＦＦ４５在人类几种细胞系 的表达差异情况。结果：成功构建原核表达质粒，表达、纯化ＤＦＦ４５蛋白并免疫动物后得到多克 隆抗体。间接ＥＬＩＳＡ法显示抗体效价达１∶２００００，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ确定抗体具有高度特异性。应用 该抗体检测发现ＤＦＦ４５在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论：ＤＦＦ４５ 多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达，为进一步研究ＤＦＦ４５基因与肿瘤及其相 关疾病的关系奠定了基础。 关键词　ＤＦＦ４５　融合蛋白　多克隆抗体 中图分类号　Ｑ７８９ 　　细胞凋亡是机体自主、有序的生理性细胞死亡过 ＤＦＦ４５蛋白 展中发挥作用。在人大肠腺癌和肺癌中， 程。凋亡过程中伴随细胞及核的固缩和碎裂，并且染 ［４５］ 的低表达可促进癌细胞的生长和淋巴结转移 。本 ［１］ ［２］ 色体ＤＮＡ降解为核小体单位 。Ｅｎａｒｉ等 研究发现 研究表达ＤＦＦ４５蛋白，纯化并制备了多克隆抗体，为进 细胞中有１对物质在细胞凋亡过程中直接参与了细胞 一步研究ＤＦＦ４５与肿瘤发生发展的关系奠定基础。 核内 ＤＮＡ的降解，并将其命名为 ＣＡＤ（ｃａｓｐａｓｅ １　材料与方法 ａｃｔｉｖａｔｅｄｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）和ＩＣＡＤ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＣＡＤ）。 在非凋亡的细胞中，ＣＡＤ与 ＩＣＡＤ以无活性的ＣＡＤ∶ １．１　材　料 ＩＣＡＤ复合物形式表达于肾、肝、脑等多种细胞，当凋亡 　　人胚肾ＨＥＫ２９３细胞ＲＮＡ逆转录产物、原核表达 诱导物刺激ｃａｓｐａｓｅ级联活化后，ｃａｓｐａｓｅ对复合物中的 载体ｐＧＥＸ５Ｘ１、真核表达载体 ｐｃＤＮＡ３．１、大肠杆菌 ＩＣＡＤ部分进行切割 ，使 ＣＡＤ从中游离出来而被激活 ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１和各种细胞系均由本实验室保存。Ｔ４ ［３］ ，进而引起 ＤＮＡ断裂和染色质固缩 。对于人来说， ＤＮＡ连接酶、标准蛋白ｍａｒｋｅｒ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；各 ＣＡＤ同源物为 ＤＮＡ裂解因子４０（ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ 种限制性内切酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡｍａｒｋｅｒ购自 ｆａｃｔｏｒ４０，ＤＦＦ４０），其抑制剂同源物为ＤＮＡ裂解因子４５ ＴｒａｎｓＧｅｎｅ公司；异丙基Ｄ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）购 β （ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ４５，ＤＦＦ４５）。ＤＦＦ４５是 自Ｓｉｇｍａ公司；ＧＳＴ琼脂糖凝胶柱购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司； Ｃａｓｐａｓｅ３激活 ＤＮＡ酶的抑制剂同时也是其底物，在凋 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００购自