基因工程4-目的基因的分离和获得及重组基因的导入中国药科大学生物工程所有课件.ppt

第四节 基因的分离和获得 中国药科大学 生物制药教研室 目标基因克隆的三大战略： 1.利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达； 2.构建感兴趣的生物个体的基因组文库或cDNA文库； 3.利用基因差异表达获得目的基因。 构建基因文库的意义 1.通过基因文库的构建贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，保存物种遗传种质。 2.从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。 3.构建基因文库是研究基因本身的需要,如基因结构的分析、基因表达和调控的研究等。 基因组文库的类型: 质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。 染色体步移(chromosome walking) 　　当基因的位置已知，但没有可用的探针，只知道同一染色体上的另外一个已经克隆的基因，就可以通过染色体步移方法克隆所需的基因。　　其基本原理是用探针筛选文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列)是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛选文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。 其基本策略是根据已知基因片段的末端序列合成探针，反复进行基因文库的筛选，知道满足需要为止。　　染色体步移是一项复杂、繁琐的技术，到目前为止，步移最大的距离时200-250kb。然而成功的报道很多，如人类的囊肿性纤维化疾病基因。 　 　　 GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库，因此为大多数人采用。与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。 b. 对mRNA进行富集 已知要分离的目的基因mRNA的分子大小，通过凝胶电泳或蔗糖密度梯度离心，回收与目的基因mRNA分子大小相近的mRNA。 分离未知分子大小的目的基因cDNA,则可把最初制备的总mRNA先通过蔗糖密度梯度离心或凝胶电泳，按mRNA分子大小分部回收mRNA。随后将每个分部回收的mRNA进行体外转译，并结合使用免疫沉淀和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技木，鉴定出目的基因的蛋白质产物。再以此分部mRNA构建cDNA基因文库。通过离心和电泳的分部分离，可以使低丰度的mRNA得以富集。 细胞中的mRNA根据其在细胞中的拷贝数，可分为两大类：一类为高丰度mRNA，通常有100种左右的不同的mRNA，每种mRNA的拷贝数在1,000至10,000间；另一类为低丰度mRNA，包括约10,000种mRNA每种的拷贝数在1至10间。 重组DNA导入受体细胞的途径 转化：transfermation，通过生物学或理化方法使质粒DNA或以质粒DNA为载体构建的重组DNA导入受体细胞内，并在受体内稳定维持和表达的过程，主要用于原核生物。 转染：transfection，是转化的一种特殊形式，指病毒或以病毒为载体构建的重组DNA导入受体细胞，并使宿主遗传性状发生改变的过程，其中包括DNA、RT-DNA及RNAi，主要用于原核生物。 转导:( transduction ) 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 1. 直接转化法 有的微生物细胞在不加任何处理的情况下就能直接摄取外源 DNA，只要外源 DNA与这样的细胞混合，在适宜的条件下悬浮培养，就能完成外源 DNA 的转化。 细菌转化 ：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫给体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株叫受体菌株。 2.化合物诱导转化法 原理：外源 DNA 与多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）、 二价阳离子（Mg 、Ca 、Mn等）混合，再与受体细胞或原生质体混合，可使外源 DNA进入细胞。 尤以 PEG应用最广，可用于原核生物细胞、动物细胞和植物原生质体的基因转化。 PEG介导基因转化 Davey 1980年和Krens1985年首先建立的。 步骤 转化培养：将制备的原生质体悬浮液与重组DNA一起保温培养，同时加入PEG在pH8-9下促进原生质体摄取DNA，从而使细胞转化。 通常使用的PEG分子量3000左右。 转化效率很