基因工程10-dna重组技术.ppt

Take a donor egg, suck out the nucleus, and hence the DNA, and fuse it with, say, a skin cell from the human being copied. Then, with the help of an electrical current, the reconstituted cell should begin growing into a genetic duplicate. DNA重组技术示意图 One basic cloning technique begins with the insertion of a foreign gene into a bacterial plasmid. DNA重组技术 质粒、DNA或RNA提取(Extraction) 酶切（Enzyme digest) 连接（ligation) 转化（transformation) 筛选（selection) 蛋白表达（Protein expression) 第一节 质粒和质粒提取Chapter 1 Plasmid and Plasmid extract （一）关于质粒（1）质粒的概念 质粒(Plasmid)是双链、闭环DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞染色体外的遗传因子 。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶，离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使无它们也可存活。 （2）质粒的复制 紧密控制型(Stringent control)：只在细胞周期的特定阶段进行复制。染色体不复制时, 它也不能复制。 松驰控制型(Relaxed control)：在细胞周期中随时可以复制, 有多拷贝。 蛋白质合成抑制剂-氯霉素使细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受抑制。紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制。 （3）质粒的不相容性(Incompatibility) 同一复制系统的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中,两种质粒彼此竞争。细胞生长几代后,某个质粒丢失。 发酵出发菌株 单质粒 （4）质粒载体 质粒载体是由天然质粒经人工改造而成。与天然质粒相比, 质粒载体带有选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和人工合成多克隆位点序列,并去掉了许多非必需序列,使分子量减小,便于基因工程操作。 理想克隆载体的特性 分子量小、多拷贝、松驰控制型 具有多种常用的限制性内切酶的单切点 能插入较大的外源DNA片段 具有容易操作的检测表型。 常用质粒载体大小在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。 pBR322old-style general purpose plasmid pUC19 Multiple Cloning Sequence (Polylinker) （二）提取质粒DNA的方法 3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。 用溶菌酶破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜。经溶菌酶和SDS处理后,细菌染色体DNA会缠绕在细胞碎片上,而质粒比细菌染色体DNA小得多，所以3000-5000g离心后，质粒留在上清液中。 用强热或酸、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性, 而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)两条链不会分开。 当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性蛋白质和细胞碎片缠绕在一起, 而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然超螺旋分子,并溶解于液相中。 共价闭环质粒以超螺旋形式存在。提取质粒时，除超螺旋DNA外，还有其它形式质粒DNA。 如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA (Open circular DNA, 简称 ocDNA)； 如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA (Linear DNA)。 当质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。所以电泳有2~3条带。 附：试剂配制 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ： 蛋白胨(Tryptone)10 g， 酵母提取物(Yeast extract) 5 g， NaCl 10 g， 溶于800ml去离子水中， 用NaOH调pH至7.0-7.5 （有时pH试纸比pH计更可靠），加去离子水至总体积1升, 高压下蒸气灭菌20分