饲料有效磷评价与磷营养调控技术资料.ppt

REG法和差量法测定的豆粕和次粉日粮磷真消化率和内源磷排泄量比较　  植物性饲料磷消化率（%） 　　真可消化磷（g/kg，Y）预测模型　 可透析磷预测模型　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（n=21） 　　不同饲料类型真可消化磷（g/kg，Y）预测模型 试验设计 0.4%Pi 0.4%Pi 0.6%Pi 0.8%Pi 1.0%Pi A B C D 60日龄体重约1.5Kg的三黄肉鸡40只，随机分为4组，每组5个重复，每个重复2只鸡。 测定方法 DNase I消化 小肠总RNA的提取及完整性检测 RNA反转录 实时定量PCR(Real-Time PCR) - 采用Trizol为裂解液，按步骤提取 - 跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性 - 使用DNase I对总RNA消化，以去除基因组痕量DNA污染 - 参照Invitrogen M-MLV反转录试剂盒使用方法进行cDNA第一链合成 - PCR扩增管家基因检测反转录是否成功 - 仪器使用ABI PRISM 7900HT 在普通PCR仪上对β-actin和Na/Pi-IIb的部分片段进行扩增 退火温度范围55～62℃；引物和cDNA模板用量为0.5～1.5μL 引物设计 反应条件优化摸索 β-actin： sense5’-CAGCCATCTTTCTTGGGTAT-3’ antisense5’-GTTTAGAAGCATTTGCGGTG-3’ Na/Pi-IIb： sense5’-GAAAGTGGTGAAGATGCC-3’ antisense5’-AAGTATGAGACCGATGGC-3’ 最终反应采用57℃退火温度，引物和模板用量均为1μL 。各样品引物扩增的Ct值由各自的扩增曲线分别得出，根据公式：2-△△Ct=2- (Ct目的基因—Ct管家基因) ，计算出样品中Na/Pi-IIb mRNA与β-actin相对表达丰度。 研究结果：反应条件 总RNA 1%琼脂糖电泳图 PCR条件优化效果图 β-actin标准曲线： Y=-3.107*LOG(X)+21.149， Eff.=100.98%，Slope:-3.1068，R2=0.988 Na/Pi-IIb标准曲线：Y=-3.325*LOG(X)+32.521， Eff.=98.82%，Slope:-3.325，R2=0.981 Na/Pi-IIb溶解曲线 β-actin溶解曲线 饲粮不同磷水平对肉鸡肠道Na/Pi-IIb mRNA表达的影响 （以对照组B的肉鸡空肠前段组织为对照样品，即对照样品2-△△Ct值为1） 与照组0.6%总磷水平相比，较低磷（TP 0.4%）日粮提高空肠全段的Na/Pi-IIb mRNA表达量。较高磷（TP 0.8%、1.0%）日粮降低十二指肠和空肠全段Na/Pi-IIb mRNA表达。 Proximal jejunum Distal jejunum TP 0.4% 0.6% 0.8% 1.0% 十二指肠 空肠前段 空肠后段 回 肠 21.87±2.26A 15.39±3.87A 13.59±1.10a 21.41±2.55A 16.05±2.87b 12.34±1.33Aa 12.05±1.97ab 15.85±2.24a 14.58±2.25ab 12.01±0.79ab 10.48±125a 15.05±2.24a 12.78±0.76a 11.55±1.54b 9.86±0.69a 15.34±1.54a 不同磷水平条件下各肠段对饲料磷的体外吸收率 提示：四组日粮磷体外吸收率均表现为从十二指肠到空肠后段 逐渐下降然后在回肠段升高的趋势。 较低磷（0.4%）时磷体外吸收率显著高于其他磷水平（P0.05） 饲粮磷水平调控Na/Pi-IIb mRNA基因表达。在饲粮磷水平较低时，Na/Pi-IIb mRNA表达量随饲粮磷水平升高而增加；当饲粮磷水平升高到一定程度时，则抑制Na/Pi-IIb mRNA表达。 本试验中TP 0.4%为三黄肉鸡育肥期适宜的日粮磷添加水平。 小结 * 代谢试验 外翻肠囊 RT-PCR 饲料磷体外吸收率与其表观消化率相关性低（P0.05）； 饲料磷体外吸收率与其真消化 率呈极显著相关性（P0.01）。 磷在空肠段的吸收主要以Na/Pi-IIb磷转运的主动运输为主，而在回肠中则以自由扩散占优势 磷的绝对吸收量随日粮磷水平 的提高而增加，但吸收效率降低。 不同日粮磷水平下，1,25-(OH)2D3对大鼠 磷吸收的调控作用 Experiments 2 试验研究 （曹满湖，方热军等. 2010，中国农业科学；动物营养