纳米TiO_2固载脂肪酶及其固载界面表征.pdfVIP

第 29卷第 2期 安 徽 工 程 大 学 学 报 V01．29．No．2 2014年 6月 JournalofAnhuiPolytechnicUniversity Jun．，2014 文章编号：16722—477(2014)02—0009—04 纳米 TiO2固载脂肪酶及其固载界面表征 周 朋，陶玉贵 ，曹 宁，张 健 ，刘任龙 (安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000) 摘要：以3种不同形貌的纳米 TiO。为载体固定化脂肪酶，研究载体形貌、酶添加量、pH值、温度和时间对固 载酶活性的影响．研究结果表 明，纳米线形貌 TiOz固定化效果最好 ，最优 固定化条件为加酶量 0．25g／25mL 溶液、pH7．0、固载温度 4O℃、固载时间6．3h．利用 SEM、XRD、FT—IR等对 固载酶及其界面进行表征，SEM 和XRD结果表明，脂肪酶吸附于纳米线 TiO。载体表面，且未改变纳米线TiOz的晶型结构；FT—IR表征表明 固载酶含有脂肪酶的特征吸收峰；比表面积分析显示固定化后样品的BET明显减小，表明脂肪酶在纳米线 TiOz表面进行物理型吸附． 关 键 词 ：纳米 TiOz；脂肪酶 ；固定化 ；表征 中图分类号 ：TB34 文献标识码 ：A 脂肪酶又称三酰甘油酯水解酶(EC3．1．1．3)，可以专一高效地催化分解甘油三酯，普遍存在于动植物 和微生物中[1]．脂肪酶广泛应用于医药 、化工、食 品和化妆品等行业 [4]．相较于游离酶而言，固定化酶有 着更好 的操作稳定性 ，有利于下游产物的分离纯化 ，便于回收重复利用[6]． 目前，利用纳米无机材料作为酶固定化的载体 已得到广泛应用[7]．无机材料 TiO 对有机物质具有 较好的吸附性，生物亲和性好、无毒害，化学稳定性好，机械强度高，将会是很好的酶固定化载体Dqo]．在酶 的固定化 中，酶与载体表面的作用方式可能会引起酶结构的变异，增加底物与酶活中心的空间位阻，从而 导致酶活力下降、酶固定量也受到限制．因而，研究酶蛋白在载体表面的界面特性是酶固定化的关键[1． 本文在前期仿生合成纳米 TiO。基础上 ，分别以仿生合成的纳米线 、纳米花以及纳米片 TiO 为载体 进行脂肪酶 固定化 ，进一步研究固定化效果最好 的载体．采用 SEM、XRD、FT—IR以及 比表面积分析仪等 表征固定化酶，对纳米 TiO 载体固定脂肪酶的界面特性进行了初步探究． 1 实验部分 1．1 实验药品 脂肪酶，牛血清蛋 白，考马斯亮蓝，聚乙烯醇(PVP)，无水 乙醇，橄榄油，均为化学纯，国药集团化学试 剂有限公司；TiO2纳米线 (锐钛矿 ，S哪 一312．58IT1。／g，PoreRadiusDv(r)一 16．69am)、纳米花 (Tio2／ZnO复合体，SBET=219．54m。／g，PoreRadiusDv(r)一18．53nm)以及纳米片 (钛酸盐，SBET= 169．50m。／g，PoreRadiusDv(r)：48．44nm)载体均为实验室 自制． 1．2 酶固定化方法 在 25mL浓度为 0．1mol／L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH一7．5)中加入一定量的酶粉 ，搅拌 0．5h使 之充分溶解．然后将 0．5g载体 (静置在 pH=7．0，浓度 0．1mol／mL的磷酸缓冲溶液 24h)加入脂肪酶的 PBS中，室温下搅拌一定时间，过滤，将 固定化酶用滤液反覆洗涤，收集滤液，滤液待用，以便测定滤液 中 酶的活力．所得的固体干燥至恒重 ，得到固定化酶． 1．3 蛋白负载率和酶活测定方法 固定化酶蛋白含量的测定采用Brandford法． 固定化效率 ( )=(初始酶液总蛋 白一残液总蛋 白)／W始酶液总蛋 白X100 ． 固定化酶活力采用橄榄油乳化及 NaOH滴定法测定．固定化酶活力单位 ：每克固定化酶在 37℃下， 收稿 日期 ：2013—05—22 基金项 目：安徽省高校 自然科学基金资助项 目(KJ2012A034)；安徽省 自然科学基金资助项 目(130808MC51) 作者简介：周 朋 (1983一)，男 ，安徽芜湖人 ，助理实验师，硕士． 通讯作者：陶玉贵(1965一)，男 ，安徽无为人，教授，硕导．