生物化学-核酸教程.ppt

* 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是沿待合成引物的3‘端向5‘端合成，相邻的核苷酸通过3‘→5‘磷酸二酯键连接。 第一步，三氯乙酸和预先连接在固相载体（CPG）上的核苷酸反应（其活性基团处于被保护状态），脱去核苷酸5‘-羟基的保护基团DMT，获得游离的5‘-羟基； 第二步，合成DNA的原料（亚磷酰胺保护的核苷酸单体）与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3‘端被活化，5‘-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5‘-羟基发生缩合反应； 　 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5‘-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉； 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5‘-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，测定OD260定量，根据定单要求分装 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是沿待合成引物的3‘端向5‘端合成，相邻的核苷酸通过3‘→5‘磷酸二酯键连接。 第一步，三氯乙酸和预先连接在固相载体（CPG）上的核苷酸反应（其活性基团处于被保护状态），脱去核苷酸5‘-羟基的保护基团DMT，获得游离的5‘-羟基； 第二步，合成DNA的原料（亚磷酰胺保护的核苷酸单体）与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3‘端被活化，5‘-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5‘-羟基发生缩合反应； 　 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5‘-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉； 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5‘-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，测定OD260定量，根据定单要求分装 * * * * Che, A. Using Synthetic Nucleic Acids for in vivo System Assembly. * * * * * /wiki/PNA Che, A. Using Synthetic Nucleic Acids for in vivo System Assembly. * * /wiki/Locked_nucleic_acid Che, A. Using Synthetic Nucleic Acids for in vivo System Assembly. * * * * * * 2．发卡结构与 Aptamer：开始于生物化学，得宠于化学生物学！ 三股螺旋在低PH非常稳定，因为C GC+三体有一个质子化的胞嘧啶。一条链上的一段只含有嘧啶或嘌呤的较长序列最容易形成三股螺旋。一些三股螺旋含有两条嘧啶链和一条嘌呤链，另一些则含有两条嘌呤链和一条嘧啶链。 * * * * * * * * * * DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用 * 核小体 念珠状结构 核小体链进一步盘绕、折叠形成染色质丝 组成突环 玫瑰花结 螺线圈 由螺线圈组装成染色单体 * * * * * * 增色效应：单链多核苷酸的摩托尔吸光系数比双螺旋的摩尔吸光系数要高，所以核酸发生变性时，摩尔吸光系数升高约25%，称为增色效应。揽性后摩托尔吸光系数值又降低，称为减色效应 * * * 在pH7.0 0.165mon/L NaCl 中DNA的Tm值与G-C的含量之间有正比关系，G-C对含量越多，Tm值越高，这是因为GC对之间有3个氢键，所以GC多的DAN分子更稳定。 3．DNA的复性 指变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的单链可以重新结合成双螺旋链。 复性条件：缓慢降冷却（退火），分子量越