松材线虫RNA聚合酶基因的RNA干扰研究.pdfVIP

圆 澎 右Jl：彳干学 2007年第6期 松材线虫RNA聚合酶基因的RNA干扰研究 王守先 ，牛宝龙。，沈卫锋。，翁宏飚。，何丽华。，蒋 平 ，吾中良 ，孟智启 (1．浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021；2．浙江林学院 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300； 3．浙江省森林病虫害防治检疫站，浙江杭州 310020) 摘 要：克隆了松材线虫 (Bursaphelenchus xylophilus)RNA聚合酶基因片段，构建大量表达松材线虫RNA聚 合酶基因片段的特异双链RNA(dsRNA)表达载体，并用表达的双链RNA(dsRNA)对松材线虫进行了RNA干扰 实验。结果表明，松材线虫浸泡在20℃的RNA聚合酶基因双链 RNA(dsRNA)溶液中干扰 24 h后再培养12 d， 其繁殖倍数为73．2；对照处理的繁殖倍数为322．8，两者的繁殖倍数相差4．4倍；松材线虫浸泡在4℃的 RNA聚 合酶基因双链 RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d，其繁殖倍数为120．8。RNA聚合酶基因的双链 RNA (dsRNA)浸泡明显的抑制了松材线虫的繁殖；并且发现利用浸泡法对线虫进行干扰试验，双链 RNA(dsRNA) 20℃浸泡的干扰效果要好于前人报道4℃浸泡的干扰效果。 关键词：松材线虫；双链 RNA(dsRNA)；RNA干扰 中图分类号：s763．712．48 文献标识码：A 文章编号：0528 9ol7(2007)06—0690．04 松材线虫病 (Bursaphelenchus xylophilus)是松 导特异性地降解相应序列的mRNA，从而阻断相应 树上的一种毁灭性病害，具有危害性大、传播速度 基因表 达。RNA干扰 现象首 先 由 Guo和 快、防治难度大等特点，是世界性检疫对象。目前 Kemphues1995年在试图使用 RNA来阻断成熟幼胚 对松材线虫病的防治主要是利用高效的内吸性杀线 的基因表达的实验中发现的 。1998年Fire等人在 虫剂进行树干打孔注射或者根部浇灌“ 。但这种 研究秀丽隐杆线虫基因沉默机制时也发现了RNA 防治方法成本过高，仅适合小面积观赏树种和名贵 干扰现象。它们发现双链 RNA能够比反义RNA 树种的应用。试验表明很多真菌具有杀线虫活性， (siRNA)或正义 RNA更有效地关闭基因的表达， 如研究者分别从树体口 和土壤H 中分离得到对线虫 他们称这种现象为RNA干扰现象。进一步研究发 有毒杀、抑制作用的真菌，认为这些真菌具有防治 现，通过舔食能够转录合成 dsRNA的大肠杆菌， 线虫的潜力。用转基因方法培育抗线虫植物也是一 同样可以诱发秀丽隐杆线虫表现RNA干扰现象 。 个热门的领域，转入的基因主要包括诱导植物系统 利用该技术 Fr~er AG(2000)与 Gonczy P(2000) 产生获得性抗体物质的基因，对线虫具有毒性的外 分别成功研究了秀丽隐杆线虫第1与第3号染色体 源蛋白的基因、线虫分泌物特异抗体基因，以及科 上400多个基因的功能 。目前对线虫进行 RNA 学家们从抗性植株中克隆得到的抗性基因等 。由 干扰实验时，双链RNA(dsRNA)的导入方法主要 于松材线虫病传播快，一旦发生则很难控制，所以 有3种¨ ：喂饲法、注射法和浸泡法。本研究运 在防治上要贯彻 “预防为主，防重于治”的方针。 用RNA干扰技术 (RNA interference，RNAi)在实验 树干注射治疗成本高，不宜大面积推广使用。用飞 室条件下利用浸泡法对松材线虫的生长发育进行干 机喷撒化学药剂防治天牛效果也不太理想，具有负 扰，研究其干扰效果，为利用生物技术防治松材线 面效应。生物防治虽具有明显的生态效益，也进行