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Real Time PCR 技术原理及常见问题 Promega GoTaq® Amplification Family 目录 1. End-Point vs. Real Time PCR(终点法与实时荧光定量PCR） 1 2. 实时荧光定量PCR 原理 2 2.A 探针法原理——FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光共振能量转移) 2 2.B 染料法原理——特异性与双链DNA 结合的荧光染料 3 3. Real Time PCR 数据分析 4 4. 相对定量 vs 绝对定量 5 4.A 相对定量 5 4.B 绝对定量 6 5. 常见问题 7 5.A 荧光信号升高太高，超出检测范围： 7 5.B 高浓度模板反而CT 值更大甚至检测不到 7 5.C 阴性对照有扩增 8 5.D 熔解曲线有2 个或2 个以上的峰 9 5.E ΔRn 不超过1，在低水平徘徊 9 5.F 扩增效率低于90% 10 5.G 扩增效率高于110% 10 5.H 标准曲线R2 小于0.98 10 1. End-Point vs. Real Time PCR(终点法与实时荧光定量PCR） PCR 是对特定的 DNA 序列的进行定性或定量检测最灵敏的方法之一。理论上来说，PCR 反应过程中生 成的 DNA 产物是呈指数方式增加的，即每增加一个循环，PCR 产物加倍。但随着反应循环数的增加，产物 积累、原料消耗，最终 PCR 反应无法继续维持指数方式的扩增，而进入线性期和平台期。整个 PCR 反应过 程中，只有在指数期，PCR 产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系（PCR 产物量=初始模板量×2N， N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期，PCR 产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多少是不准 确的。 传统的 PCR 又称为终点法 PCR，常用凝胶电泳的方法来检测PCR 产物的量，并由此推断初始模板的含 量高低。由于凝胶成像方法本身灵敏度的局限，终点法 PCR 只能检测反应平台期的产物量，得出的结论不 可靠。而在实时荧光定量PCR （Real Time PCR）中，特殊荧光染料的加入，使仪器可以对整个PCR 反应扩增 过程进行实时的监测。因此可以在PCR 反应处于指数期时，检测 PCR 产物的量，并且由此来推断初始模板 的含量，结果更加准确。 普洛麦格（北京）生物技术有限公司 Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 电话：800 810 8133，010 中文网址： 英文网址： 1 / 11 2. 实时荧光定量PCR 原理 实时荧光定量PCR 所使用的荧光化学主要分为两种类型：荧光探针法和荧光染料法。 2.A 探针法原理——FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光共振能量转移) 荧光探针法是在PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针。该探针同样为一段oligo DNA，其结合的位点位于 PCR 上下游引物结合位点之间。探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭 荧光基团。探针完整时，由于FRET 效应，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR 扩增时，Taq 酶 的5’－3’ 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同 步。 普洛麦格（北京）生物技术有限公司 Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 电话：800 810 8133，010 中文网址：