凝胶电泳应用于糖蛋白的分离鉴定.pptVIP

二维电泳应用于糖蛋白的分离鉴定 目 录 糖蛋白（glycoprotein ） 膜蛋白中的糖 膜蛋白分子中的糖 糖蛋白的结构 糖基化 糖基化 是蛋白质翻译后修饰最重要的方式之 一，是必需的生理过程，对蛋白质生物学功能的 正确发挥起着至关重要的作用。 糖蛋白的形成是糖基化的一种表现形式 糖基化 糖蛋白 分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤 糖蛋白的分离纯化方法 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。 凝胶电泳 二维电泳 双向凝胶电泳（二维电泳） 第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状 。 二维电泳中糖蛋白的染色方法 基于PAS反应的染色方法 PAS--periodic acid-Schiff’s base method (高碘酸/过碘酸-席夫式碱方法) 原理 在过碘酸的作用下，糖蛋白中糖链上相邻两个碳原子上的羟基被氧化成醛基，醛基再与带有紫外或荧光基团的氨基形成席夫式碱，在紫外或荧光灯下检测即可。 席夫式碱 ——N原子和C原子双键结合的一类化合物 基于PAS反应的染色方法 糖蛋白 1 糖基化 2 凝胶电泳—分离纯化技术 3 基于PAS反应的染色方法 4 定义 由短的寡糖链与蛋白质共价结合构成的分子。 特点 蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表现为蛋白质的特性。 细胞膜、溶酶体、细胞外液 分布 这些寡糖链常常是具分支的杂糖链，不呈现重复的双糖系列，一般由2-10个单体（少于15）组成，未端成员常常是唾液酸或L-岩藻糖。 单糖的种类 葡萄糖(Glu) 半乳糖(Gal) 甘露糖(Man) N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) 岩藻糖(Fuc) N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) N-乙酰神经氨酸(NeuAc) 连接方式 N-连接： O-连接： 糖蛋白的结构 生物活性 折叠 溶解度 半衰期 抗原性 蛋白质 糖链 Capillary electrophoresis 毛细管电泳 MLC 多维液相色谱 electroblottillg 电印迹技术 gelelectrophoresis 凝胶电泳 电泳技术的基本原理 电泳：带电粒子在电场中的定向移动。 等电聚焦(Isoelectro focusing IEF) 原理 Pr为两性电解质，不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，因此pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。 EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的,稳定的,线性的pH)。 原理 当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。 如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。 只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。 等电聚焦(Isoelectro focusing IEF) 等电聚焦(Isoelectro focusing IEF) 返回 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 插入梳子 聚丙烯酰胺凝胶电泳 加缓冲液 加 样 聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳 剥胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 标准Marker蛋白的电泳图谱 聚丙烯酰胺凝胶电泳 可直接在胶上对糖蛋白进行酸水解 或酶解后进行后续的鉴定分析或糖链的结构分析。 可以同时分离多个复杂混合物 优势 胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3 加