基因工程菌之转化废弃物产生柴油汇编.docVIP

一.生物柴油的主要特性 虽然生物柴油油脂来源分散，品种复杂，较之普通柴油相比，低温启动性能不佳。但其作为一种可再生的、可持续发展的能源，不仅比普通柴油对环境更友好，而且可直接现有柴油机中使用，无需改造柴油机或者更换发动机。 生物柴油与普通柴油相比，生物柴油具有以下优良特性 1.生物柴油中多环芳香族化合物及硫，铅，卤素等有害物质含量低，大大减少污染问题。 2.生物柴油闪点高，有利于运输、储存和使用。 3.生物柴油的十六烷值大于，其燃烧性优于柴油。 4.生物柴油的运动黏度高，更容易在汽缸内壁形成一层油膜，降低机件磨损，具有较好的润二.国际生物柴油生产使用现状 目前世界各国，尤其是发达国家，都致力于开发高效无污染的生物质能利用技术。生柴油诞生于年，欧洲已成为全球化生物柴油的主要生产地。美国、意大利、法国和亚洲的一些国家和地区纷纷建立起商品化生物柴油生产基地，并通过政策优惠促使生物柴油产业蓬勃发展。生物柴生物柴油的生产原料 一般来说，生物柴油的原料可以分为三类：各种天然的植物油脂（可食用或不可 食用）以及动物脂肪、食品工业的废油和微生物油脂等—。油含氧量高，可达，燃烧时排烟少，点火性能优于石化柴油。生物柴油的生产原料 一般来说，生物柴油的原料可以分为三类：各种天然的植物油脂. 三．产生物柴油基因工程菌的构建 1.材料 菌种和培养基培养基：、蛋白胨、酵母提取物，固体培养基含琼脂。该培养基可用作斜面保藏培养基和种子培养基。培养基均在灭菌。液体培养基分装在的摇瓶中，每瓶装液量为本研究所使用的菌种和质粒见表。 2.化学试剂 质粒抽提液：溶液、葡萄糖溶液溶液、琼脂糖凝胶电泳缓冲液：：醋酸，硼酸、溴乙锭（室温避光保存，工作浓度为甘油、溴酚蓝、二甲苯青、感受态制备溶液：甘油考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝溶于乙醇后，加入磷酸，去离子水定容至，用滤纸过滤，室温保存。蛋白电泳缓冲液：丙烯酰胺溶液：取丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，定容至，用滤膜过滤后置于棕色瓶中°避光保存。分离胶缓冲液：称取浓盐酸调节至去离子水定容至，保存。浓缩胶缓冲液：称取浓盐酸调节至，去离子水定容保存。电泳缓冲液：称取甘氨酸，溶于去离子水中，定容至。溴酚蓝、甘油、巯基乙醇，去离子水定容至，巯基乙醇用前加入。考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝、冰醋酸、无水乙醇，室温保存。脱色液：冰醋酸、无水乙醇，定容至。产物回收试剂盒、凝胶回收试剂盒为公司产品；、为日本公司产品；蛋白电泳为公司产品；为公司产品；所有限制性内切酶、、聚合酶、、聚合酶、等为司产品引物由上海英骏生物技术有限公司合成琼脂糖、饱和酚（、溴乙锭、卡那霉素、氨节青霉素、丙炼酰胺、甲叉双丙烯酰胺、巯基乙醇、甘油、、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝等为上海生工生物工程服务有限公司产品；酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、硼酸、醋酸钾、甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿等为分析纯，上述试剂均为国药集团药业股份有限公司产品。 3.仪器设备 超净台上海博迅、数显鼓风干燥箱上海博迅、火菌锅上海博迅、全温恒温摇床华利达、脱色摇床华利达、电子天平梅特勒托利多、计梅特勒托利多、高速冷冻离心机上海天美、磁力搅拌器杭州仪表、数控超声清洗器（昆山超声仪器、超声波细胞粉碎机宁波新芝，紫外可见光分光光度计上海美谱达、自动凝胶图像分析仪上海培清、电泳仪上海天能） 4.方法 4.1基因组的提取 采用等改进的基因组快速提取法。取液体培养和菌液各菌体用洗漆两次，用重悬菌体加入终浓度为的溶菌酶°作用半小时加入饱和酚（涡旋振荡后，于°取上清，用等体积氯仿异戊醇（反复抽提至两相间无白色沉淀取上清，加入终浓度为，作用等体积氯仿异戊醇抽提取上清电泳验证后可直接用于PCR. 4.2 基因克隆 采用数据库中已报道的的丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氧酶中的蜡酯合成酶二酰基甘油转移酶基因序歹作为模板，用软件分别设计引物，引物见表。扩增得到的序列通过克隆至载体后测序。并采用酶切连接的方法，将扩增正确的片段和分别连接至，得到重组质粒和以及。 4.3受态细胞的制备 从保存的冻存管中用接种环挑取一环菌液于平板上划线培养。待长出单菌落后用灭菌枪头挑取单菌落接种于液体培养基试管中，振荡培养小时左右至对数生长期。以接种量转接于液体培养基中，°振荡培养至约左右。将菌悬液分装至个灭菌离心管中，离心。弃上清，沉淀用预冷的溶液重悬，离心。弃上清，沉淀用预冷的：溶液重悬，冰上放置离心。弃上清，用预冷的溶液悬浮菌体，轻轻混勾后每管分装于火菌的离心管中，保存待用。 4.4质粒提取 取在培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），离心，弃尽上清。加悬浮细菌沉淀，悬浮需均勾，不应留有小的菌块。确认中已加入。加温和并充分地上下翻转次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过。使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的中和中的，降低