感受态细胞制作.docxVIP

方法七：Inoue法制备超级感受态细胞越干净越好，越冷越好。1、将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。用Milli-Q水配置250ml LB液体培养基。高压灭菌。2、准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。高压灭菌。3、于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。4、晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250ml SOB培养基（无抗性）中， 18-22℃，200rpm摇过夜。5、第二天上午测量细菌OD600值。Top10, JM109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5α则要到下午4-6点钟（可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等）。6、将OD600达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。7、4℃，4000rpm（2500g），10min集菌（用新的50ml 进口离心管）。8、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，大力向下击打，尽可能去掉剩余SOB(LB)。9、每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者与感受态效率没有直接关系）。10、超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀，冰上10min。11、4℃，4000rpm，10min集菌。12、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。13、每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌。14、轻轻来回混匀（记住要轻轻）。置于冰上10min。15、将冰浴的感受态细胞分装到事先灭菌后并放到-20或4℃的EP管中，一个一个丢到液氮罐里，然后冻到-80（建议100μl每管，传说液氮速冻可以提高5倍的感受态效率）。感受态效率在108-107不等。/experiment/430/431/432/14601.htmInoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞关键词：?Inoue法?大肠杆菌?感受态2008-07-21 00:00?来源：互联网?点击次数：1515实验步骤：1、Inoculate from an overnight grown in LB.从培养过夜的LB平板上挑取单菌落。2、Grow in 250 ml SOB at 18℃ until OD600?= 0.6.(0.3)接种于250ml SOB，18度培养至OD＝0.6。3、On ice for 10 minutes.菌液置冰上10分钟。4、Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA or 3000 rpm in a Beckman J-6B centrifuge)for 10 min.at 4℃.4度2500g离心10分钟。5、Resuspend cells gently in 80 ml of ice cold TB.小心用80ml预冷TB重悬细胞。6、On ice for 10 minutes.(30min)菌液置冰上10分钟。7、Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA,5500 rpm in a Sorvall SS-34,or 3000 rpm in a Beckman J-6B centrifuge)for 10 min.at 4℃.4度2500g离心10分钟。8、Resuspend cells gently in 20 ml of ice cold TB.小心用20ml预冷TB重悬细胞。9、Add DMSO to a final concentration of 7%.加入DMSO至终浓度7%。10、Place on ice for 10 minutes.置冰上10分钟。11、Aliquot into 1-2 ml and freeze in liquid nitrogen.分装，液氮速冻。12、Store in liquid nitrogen or -80oC.冻存。SOB Medium and TB (Transformation Buffer)SOB?2% (w/v) bacto tryptone?TB?0.5% (w/v) yeast extract?10 mM