酵母静止的细胞中的肌动蛋白体是一个可立即使用的肌动蛋白储备.doc

酵母静止的细胞中的肌动蛋白体:一个可立即使用的肌动蛋白储备? 大多数真核细胞在其生命的大多数时间处于一个静止的状态,准备特定的增殖信号。在酿酒酵母中,进入和退出静止状态仅仅取决于环境中的可利用的营养物质。从静止到增殖的转变不仅需要剧烈的代谢变化，还需要一个完整的多种细胞结构的重建。在这里,我们描述了一个酵母静止状态特异的肌动蛋白细胞骨架组织。当细胞停止分裂,肌动蛋白重组为一个我们称为“肌动蛋白体”的结构。我们的研究表明肌动蛋白体包括F-肌动蛋白和一些肌动蛋白结合蛋白，如丝束蛋白和成帽蛋白质。此外,通过与肌动蛋白斑或肌动蛋白线的对比,我们发现肌动蛋白体大多是固定的,并且我们没有发现任何肌动蛋白丝的转换。最后,我们的研究表明,在细胞的再培养中肌动蛋白体迅速消失, 而且在蛋白质从头合成缺乏的情况下肌动蛋白线和斑可以被装配成肌动蛋白体。这使我们提出,肌动蛋白体是一个肌动蛋白的储备,它可以在再次进入一个增殖周期时为肌动蛋白线和斑的形成而迅速动员。 介绍 细胞生长和增殖的控制是生命的一个关键特性。大多数原核和真核细胞其最大部分的寿命是处于一个称为静止的非增殖状态。令人惊讶的是,一个关于多种细胞过程控制细胞增殖周期的巨大的信息体是可以利用的, 而生物学上的静止周期却鲜为人知。静止周期是细胞退出增殖周期的一个过程；进入并且维持一个稳定的,非增殖状态;最后,在特殊的环境条件下,又返回到细胞分裂周期。破解从增殖到静止的转换机制是一个巨大而紧急的研究领域。在多细胞生物体,细胞增殖主要依赖于生长因子和激素,也可能依赖于涉及整个生物环境的参数。因此研究这些生物中的静止周期是非常具有挑战性的。相比之下,单细胞微生物如酿酒酵母的增殖“完全”取决于环境中营养物质的可用性,因此更适合研究涉及进入和退出静止周期的过程。 在营养枯竭时,增殖的酵母细胞完成细胞周期,停止成长,并且进入静止状态作为不萌发的细胞。静止状态的正确建立显然涉及由一组复杂的级联信号,如TOR和RAS途径控制的活跃的过程。此外,酵母细胞进入静止将彻底地修改他们的新陈代谢。他们积累碳水化合物、聚磷酸盐,并且大大降低蛋白质的合成率。最近,DNA微阵列分析表明,尽管在进入静止后大多数基因下调,然而一些特定基因的转录被诱导,此外,一些特殊的转录物在静止细胞中富集。因而,这些研究揭示了发生在进入静止状态时特定的表达谱的“重新编程”。在细胞水平上,酵母细胞进入静止状态后产生出一个厚厚的细胞壁,它赋予了细胞一个对温度、渗透压或化学压力更高的耐受性。此外,静止的酵母细胞显示为凝聚的染色体和点状的线粒体网络;然而, 在进入静止状态时其其他细胞结构潜在的重塑则很少为人所知。 在肌动蛋白细胞骨架是最动态细胞装置之一,而且对于各种不同的细胞过程如细胞形态、迁移、极化、收缩、分裂或细胞内运输等都是至关重要的。对于协调微丝(肌动蛋白)快速组装和去组装及调节参与各种结构如应力纤维或收缩环的形成等巨大数量的信号通路, 肌动蛋白网络是高度响应的。活跃的增殖酵母细胞显示三个包含F-肌动蛋白的结构:肌动蛋白丝,作为运输小泡,细胞器和信使rna的极向运输的道路; 内吞作用所需的肌动蛋白斑;肌动蛋白-肌球蛋白细胞动力环。一整套的保守的肌动蛋白结合蛋白(ABPs)紧密协调这些高度动态的包含f-肌动蛋白的结构的形成和维持。尽管许多研究描述了复杂的分子间相互作用的网络,这些相互作用在分裂活跃的酵母细胞中调节肌动蛋白细胞骨架,但是很少有人了解它在静止细胞中的组织作用。 在这里,我们仔细地描绘了出芽酵母在进入和退出静止状态时肌动蛋白细胞骨架的重建。我们描述了一个静止细胞特异的肌动蛋白细胞骨架组织,我们将其命名为“肌动蛋白体”。我们进一步解释了这一新结构的构成、定位和动态性。最后,我们证明了当补充营养使细胞退出静止状态时肌动蛋白体的命运。根据我们的数据,我们提出肌动蛋白体作为肌动蛋白储备,可以立即用于细胞进入下一个增殖周期。 材料和方法 菌株,培养基,和质粒 菌株。除了特定的外, 在这项研究中所采用的所有的酿酒酵母菌株都是对BY4742或BY4741(以s288c为背景)等基因系的，来自于Euroscarf(Frankfurt,德国)并且如表1所列。携带绿色荧光蛋白(GFP)融合物的酵母菌株来自于英杰公司(Carlsbad,CA)。 培养基。YPDA培养基如前所述。SD casa培养基中补充1.8mM尿嘧啶、0.2 mM色氨酸和0.3 mM腺嘌呤。包含2%乳酸的培养基在Chateaubodeau等(1976)中有描述,而含N3甘油的培养基在Lefebvre-Legendre 等(2001)中有描述，在此基础上补充2%的乙醇。为了测试在营养匮乏时的可行性,我们使用一个含有0.1%的葡萄糖和赤藓红的SD casa WAV培养基，如Bonneu 等(19