生物相容性试验.DOC

生物相容性试验 材料浸提液的制备 材料细胞培养液浸提液的制备 将无菌材料切成1.0mm×1.0mm大小的方块0. 1 g/mL的比例加入培养液, 37℃下在密闭玻璃容器中浸提24h, 吸取上清液并过滤, 得100%浸提液。试验时, 以细胞培养液稀释至所需浓度。浸提液配置好之后，应尽量尽快使用。 材料生理盐水浸提液的制备 将无菌材料切成1.0mm×1.0mm大小的方块0. 1 g/mL的比例加入生理盐水，37℃下密闭玻璃容器中浸提72h,吸取上清液并过滤, 得浸提液。 体外细胞毒性的检测 试验材料： 四甲基偶氮唑盐(MTT)（Sigma），Dmem培养基（美国HYCLON公司）胰蛋白酶，EDTA。鼠L929细胞系，苯酚溶液。 试验设备：酶联免疫检测仪 2.1 将96孔板分为3组：A组(100%浸提液组)、B组(50%浸提液组)、C组(10%浸提液组)、D组(细胞培养液阴性对照组)和E组(64g/L苯酚细胞培养液阳性对照组)，每组设10孔/板。共用96孔板4块。 2.2 L929细胞复苏传代后贴壁生长良好,在对数生长期,用0.25 %(质量分数) 胰酶和0.04 % 的EDTA 消化后吹散, 用血球计数板进行细胞计数, 用RPMI1640培液稀释细胞浓度为7×104个/ mL。用微量移液器以100μL/ 孔置于96孔板中复种10孔，在5 %CO2 、37℃标准环境下以含10 %小牛血清的RPMI1640 培养液孵育24h。 2.3 24h后，空白对照用新鲜1640 培养液交换,阴性对照用生理盐水交换，阳性对照用 0.64 %的苯酚溶液交换，试验组分别用体积分数100 %，50 %，10 %的浸提液,每孔200μL交换, 然后置于培养箱中继续培养。 2.4 分别于第1,3,5,7 d各取出一块板,每孔加50μL的5 mg/ mL MTT 溶液,继续培养2h ,然后弃去孔内液体,用pH = 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）培养洗2 次,每孔加入150μL 的DMSO。振荡10 min ,用酶标仪在490 nm 波长检测OD 值,取六孔平均值。按下列公式计算相对增殖率( relative growth rate ,RGR) 。实验前后观察细胞形态。 RGR = 实验组OD 值/ 空白对照组OD 值×100 % 然后RGR 值按表1 评分定出材料的毒性级别。 RGR/% ≥100 75～99 50～74 25～49 1～24 0 反应分级 0 1 2 3 4 5 毒性计分含义 无细胞毒性 轻微细胞毒性 中度细胞毒性 重度细胞毒性 细胞毒性计分含义（GTO标准），其中0和1可用于临床。 0 无细胞毒性 1 轻微细胞毒性 2 中度细胞毒性 3 重度细胞毒性 体内全身急性毒性反应 试验材料：20只昆明种雄性小鼠，体重20g左右，被随机分为2组，各组10只。 试验方法：试验组经尾静脉注射材料的生理盐水浸提液(1ml/20g), 注射速度0.1ml/s, 对照组注射等量生理盐水, 试验后72h内观察动物的一般状态、毒性表现和死亡情况。并于0，24, 48, 72h称量记录2组动物的体重。 局部植入后反应试验 试验材料：28只新西兰雄兔，2-3KG 肌内植入试验：采用3 %戊巴比妥钠麻醉后，在两侧背部距中线25mm处各做2个长约2cm小切口, 顿性分离肌肉形成肌腔隙, 一侧腔隙内各植入2个3mm×10mm材料, 另一侧作为空白对照，分层缝合切口。观察兔子的全身反应和行为等。分别于24h，72h，1周，3周时各处死7只兔子，观察局部反应并将样品及周围组织在5%福尔马林中固定24h ,石蜡包埋标本切片,HE染色,光学显微镜下观察并照片。 5. 皮肤刺激实验 试验材料：成年白化雄兔，体重2-3KG。7只 试验步骤： 5.1 提前24 h ,将大耳白兔背毛用剪刀尽量剪短,用棉球蘸8 %的硫化钠在脱毛部位涂成薄层,经2～3 min后,用温水洗去脱毛部位脱去的毛,再用干纱布将水擦干,脱毛的皮肤备用。 5.2 1-头部，2，5-对照组，3，6-实验组，7-尾部，4-无毛区 按图所示，将试验材料样品直接接触兔脊柱两侧的皮肤。对照样品同法应用。 检测固体物时(必要时可研成粉末)，试验材料可用水或选择一种溶剂充分湿化以保证与皮肤良好的接触性。如使用溶剂，应考虑溶剂本身对皮肤的刺激作用，这种影响应与试验材料所致的皮肤反应相