分子生物学1017.ppt

（1）在医学研究中的意义 * 确定 致病基因 * 鉴定 基因 或 基因组的 变异 （2）分析人工重组的基因 实时PCR技术的产生Taq酶、荧光双标记探针 1.发射光谱与吸收光谱重叠2.基团距离相对较近3.荧光屏蔽 定量原理： 标准曲线：Ct值与起始浓度的对数成线性关系由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的初始模板浓度 核酸分子杂交技术 是用带有标记的,已知序列的核酸片段 (单链RNA或DNA)作为探针，与待测 DNA或RNA 样品进行核酸分子杂交,来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量的一种方法。 探针 TaqMan: 水解型杂交探针 与目标序列互补 5’ Reporter 3’ Quencher 无荧光信号！ 注意：探针分子的5’端是报告荧光（Reporter flurescence ) , 而3’端是荧光素淬灭剂（Quencher）。 基团距离相对较近 变性: 无荧光信号 3’ 5’ 5’ 3’ R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation Target gene 5 3 3 5 R Q 5 3 3 5 Denature PCR 5 3 3 5 R Q R Q 5 5 primer primer 5 3 3 5 Q Q 5 5 primer primer R R 5 3 3 5 Q Q 5 5 primer primer R R Analysis of PCR result Exponential growth Cycles of real time PCR 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 全新4通道实时荧光定量PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。 核酸探针 基因组 DNA 探针：外显子区 cDNA 探针（应用最普遍）：特异性高 RNA 探针：特异性高，本底低 寡核苷酸探针：人工合成，检测突变 (1)类型 (2) 标记物 同位素: 非同位素: 32P， 35S，3H 生物素、地高辛、荧光素 二、核酸分子杂交技术 是用带有标记的,已知序列的核酸片段 (单链RNA或DNA)作为探针，与待测 DNA或RNA 样品进行核酸分子杂交,来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量的一种方法。 Detect Hybrids denature Hybridize 2. 加入变性的探针DNA 1. 变性 3. 杂交 4. 检测杂交体 二、核酸分子杂交技术 膜上印迹杂交：将待测核酸结合到固相支持物上，然后与液相中的探针进行杂交的过程. 1、Southern 杂交 (to detect DNA ) * 2、Northern 杂交 (to detect RNA)* 3、斑点杂交 4、原位杂交 5、DNA芯片 液相杂交 电泳分带后的固-液杂交 Southern印迹杂交是指将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程。 1、Southern Blot: 基本程序： 1、电泳分离DNA片段 2、DNA的转膜 3、探针与DNA的杂交 4、检测杂交信号 1975年英国人Southern创建的方法 ① ② ③ ①将内切酶消化的DNA片段进行电泳. Gel electro. Separates the sample ②胶中的DNA经变性及中和后, 转膜 Transfer ③. 标记的探针与DNA的杂交 Add probes for hybridization autoradiograph ④.检测杂交信号: 放射自显影或显色 放射自显影照片 基因组DNA 内切酶消化 DNA片段，靶基因可能被切成不同长度的片段而包含在不同片段中 琼脂糖凝胶电泳 marker 弥散云雾状 Southern 转膜 缓冲液 支持物 膜 吸水纸 胶 重组DNA 克隆扩增 内切酶消化 准备模板DNA 准备探针 靶基因片段作为标记探针的模板 重物 探针标记 同位素或荧光素 探针 双链DNA PCR或酶切 靶基因片段 重组 膜 将膜移出 基因组DNA 模板DNA与探针杂交 将探针加入杂交液中 将膜加入杂交容器中 杂交缓冲液 探针 膜 将膜移入暗盒 压上X-光片感光 曝光 阳性条带 阳性条带 第三节 基因表达的分析 一、Northern 印迹定性分析基因的表达 二、RT-PCR定量分析基因的表达 三、实时RT