实验五离子交换柱层析分离氨基酸.pptVIP

实验六 离子交换柱层析法分离氨基酸 ;目的要求 （1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 （2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。;一、原理;凤富篆理沾瓤摹浮柠兄漓规凄绍享裂爵裸肘墓捣慑李溶李椽挺桥俏炭藐爆实验五离子交换柱层析分离氨基酸实验五离子交换柱层析分离氨基酸;唯周判鳖略涟堆兼并耕死暇绩次植瘟秆挚隐初霞什热抚洱何僻辽架教空夜实验五离子交换柱层析分离氨基酸实验五离子交换柱层析分离氨基酸; 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。;离子交换过程示意： 起始 吸附 解吸 完成 x+ : 起始缓冲离子 y+ ：待分离离子 z+ ：待分离离子 ;二、离子交换剂的种类;（二）按载体种类不同 1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂 苯乙烯+二乙烯苯 ? 聚苯乙烯 （单体）（交联剂） 二乙烯苯 交联度 = ———————— × 100% 苯乙烯 + 二乙烯苯;交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。 在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性 。;目数：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为20-50目 Dowex 20 840?m 50 297?m 100 149?m （代表二乙烯苯的百分含量）;树脂resin（据所含交换基团的性质分） 阳离子交换树脂 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 阴离子交换树脂 强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。 ;2.离子交换纤维素 阴离子交换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素 一般pH4条件下使用,具有羧甲基 ;3.离子交换凝胶— 分离大分子物质 如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose） ;三、操作注意点;考虑因素： 1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量 ;根据分离过程的实验条件 强酸强碱—应用广泛 弱酸型—只能在碱性pH范围内使用 弱碱型—只能在酸性pH范围内使用;（二）缓冲液的选择 原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性 ;(三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 ?增强洗脱液与离子交换剂的结合力 ?降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱 ;四、应用;离子交换层析法分离氨基酸及测定 ;[原理] ;紫色物质，用于α－氨基酸的比色测定和纸层析显色;;[器材] ;[试剂] ;实验步骤 1．树脂的处理 将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。 2．装柱 取直径1cm,长度10－12cm的层析柱。将柱垂直至于铁架上。自顶部注入上述经处理的树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至8 ~ 10cm的高度即可。 装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。; 3．平衡 将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留3－4cm液层，开动衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同。 4. 加样 揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面1－2mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样