第六章 目的基因导入受体细胞及重组子的筛选概要1.pptVIP

■酶切电泳筛选法 通过直接电泳检测法筛选出来的重组子，插入的外源DNA不一定是目的DNA片段。通过将重组子中的质粒进行酶切，然后再进行电泳，就可将阳性克隆子筛选出来。 ■PCR检测法 外源DNA的两侧序列多为已知序列，通过PCR扩增外源DNA，然后对扩增产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。 3.核酸分子杂交检测法 4.免疫化学检测法 基本过程与核酸分子杂交检测法相似，不同的是该法使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提 条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。 ■放射性抗体检测法 ■免疫沉淀检测法 ■酶联免疫检测法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 采用非放射性标记物（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）偶合第二抗体，然后与目的蛋白抗原-抗体复合物结合，通过检测非放射性标记物从而检测到相应的蛋白抗原。 5.转译筛选法 转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方法。 ■杂交抑制转译 要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。 原理： DNA 蛋白质 mRNA 蛋白质 × 杂交 转化菌落 提取重组DNA 与总mRNA杂交 形成DNA-RNA杂种分子 将总mRNA（包括DNA-RNA分子）提取出来 体外转译 蛋白电泳放射自显影 总mRNA 体外转译 蛋白电泳放射自显影 经对比，（1）比（2）中少了一种蛋白质 找到一种转译作用被抑制了的mRNA 筛选出重组菌落（或噬菌斑） 步骤： （1） （2） （3） ■杂交选择转译 重组体库 提取DNA 固定在NC膜上 与mRNA或总RNA杂交 目的基因与对应的mRNA杂交，mRNA固定在NC膜上 将分离的mRNA进行体外转译 凝胶电泳或生物活性检测 找出单菌落重组体 6.DNA-蛋白质相互作用筛选法 原理： 外源DNA 蛋白质 能与某一特定DNA序列结合 作为探针与克隆群体杂交 翻译 克隆载体+外源DNA 受体细胞 导入 转化子 非转化子 含有克隆载体 或外源DNA 不含有克隆载体 或外源DNA 重组子 非重组子 仅含有克隆载体 含有克隆载体 +外源DNA 阳性克隆子 含有外源目的DNA 非阳性克隆子 含有外源其他DNA 图6.4 转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞 滤膜（固定抗体） + 图6.5 放射性抗体检测法 图6.6 放射性抗体检测法 加入目的基因产物的标记抗体 转化菌落 不含有目的基因 含有目的基因 涂板培养 抗原-抗体反应，菌落周围出现沉淀素 图6.7 免疫沉淀检测法 第六章 目的基因导入受体细胞及重组子的筛选 第一节 受体细胞 受体细胞（receptor cell）：又称宿主细胞或寄主细胞（host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。 1.受体细胞的概念 2.受体细胞选择所应遵循的原则 便于重组DNA分子导入。 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶缺陷型，避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。） 便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的受体细胞基因型） 遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。 受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 3.各种类型受体细胞的优缺点 （1）原核细胞 ■优点 大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 ■缺点 由于原核细胞缺乏真核生物具有的RNA转录后加工、修饰系统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得了表达，也不具有正常的生物学活性。 ■常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。 大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。 细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原 反映。目前已实现商品化的基因工