免疫实验报告2.docxVIP

沉淀反应—双向扩散【实验原理】在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫扩散就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自 由 通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容 易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。双向琼脂扩散试验是定性实验。本实验测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原。【实验方法】?制备琼脂玻片：将已加热溶化的1%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。?打孔：在凝固的琼脂糖胶上用打孔器或吸嘴按左图所示打梅花孔（孔径约3mm，孔距4mm），用针头小心挑去琼脂。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘打上小孔或切角标记。打孔完毕，将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。?加样：在中央孔加抗体，上下孔加抗原1（Ag1），左右孔加抗原2（Ag2），每孔约10μL。?温育：将琼脂糖胶置于湿盒（饭盒垫上纱布，加蒸馏水润湿）中，37℃温育12-24h。??结果观察：观察抗原抗体产生的白色沉淀线。免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。【实验结果】实验结果如上图所示，红线箭头所示部分为沉淀线。【结果分析】由本实验可以说明以人Ab与羊抗人IgG免疫血清相关，在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物。实验结果显示上下部分的抗原Ag1可以与人抗体结合，形成沉淀线，而左右部分的Ag2不能与人抗原Ab结合。这符合试验原理，证明试验操作成功。但从图片亦可看出上方的左边未见沉淀线，可能是加样时未加好，亦或是打孔时与其他孔深度相差较大。巨噬细胞吞噬实验【实验原理】巨噬细胞（macrophage，MΦ）是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。【实验方法】本实验采取体内法（1）实验前3d，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。 （2）实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀，利于吞噬。 （3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴0.03%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。 （4）高倍镜下进行观察，计数。【实验结果】实验结果如上图所示【结果分析】?在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。