非损伤性取样技术和其在保护中的应用.docxVIP

非损伤性取样技术及其在保护中的应用非损伤性取样技术及其在保护中的应用摘要：非损伤性取样即在不捕获、触及，甚至是未亲眼见到动物的情况下，收集不同形式的样品获取样品中的DNA。通过对非损伤性取样法的种类以及毛发的非损伤性取样分析方法、口腔脱落细胞的非损伤性取样分析方法、馆藏标本的非损伤性取样分析方法、粪便的非损伤性取样分析方法和其它样品的非损伤性取样分析方法的介绍，就非损伤取样法在保护遗传学中的应用及其优点、局限性和应用前景作了介绍、分析和讨论。关键词：非损伤性取样保护遗传学应用1 非损伤性取样技术的背景近年来，宏观生态学的研究逐渐深入到分子水平，即通过分子生物学技术获取动物的DNA并研究其遗传信息。在分子生态学研究，获取实验材料的方法有很多，常用的取样方法有三种，即伤害性取样、非伤害性取样和非损伤性取样。伤害性取样就是通过杀死动物而获得新鲜的肌肉、肝脏和血液等组织样品。这种取样方法对非珍稀动物来说也许是可行的，而对保护遗传学的研究对象—珍稀濒危动物而言则既不科学也不现实。因此，许多研究者已放弃了该取样方法。非伤害性取样是通过捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛、耳、尾或趾等分析样品。虽然该方法不至于导致动物死亡，但对动物特别是珍稀濒危动物均会或多或少地造成伤害。正由于这些传统取样法的缺陷，使之不可能在许多珍稀濒危动物的保护遗传学研究中得到广泛应用。因此，非损伤性取样的研究意义以及实际应用价值越来越受到重视。非损伤性取样或非损伤性基因取样，是在不捕获、触及，甚至在未亲眼见到动物的情况下，收集不同形式的样品获取样品中的DNA，样品包括毛发、粪便、尿液、脱落羽毛、含口腔脱落细胞的食物残渣、鳞片以及卵壳等。由于非损伤性取样的广泛性、随机性和便利性，使其在物种鉴别、个体识别、性别鉴定、种群亲缘关系鉴定、种群数量估计等方而得到了广泛的应用。2 非损伤取样法的种类及方法2．1 粪便粪便中含有肠道脱落细胞，人们可以从粪便中提取DNA进行遗传分析。粪便的非损伤性取样是最具有潜在价值的。它是所有非损伤性取样中最简单而且对野生动物影响最小的一种取样方法。但此法主要存在两个问题。第一，粪便中的DNA存在一定程度的降解。尽管新鲜粪便中含大量肠道脱落细胞，可大大提高遗传分析的成功率和可行性，但是在实际的野外研究，获取新鲜粪便是十分困难的。通常获取的粪便样品中DNA存在严重降解。要减缓粪便中目标DNA的降解，需要有效的保存方法。另一个问题，粪便中含有大量抑制T aq酶活性的物质，对PCR扩增效果有一定影响。在中国科学院动物研究所与英国卡迪夫大学合作进行的大熊猫保护遗传学和系统地理学的研究中，利用烘干的大熊猫粪便作为分析样品，从中也成功地扩增出500~800bp的mtDNA片段和核DNA微卫星位点。由此可见，粪便的非损伤性取样在濒危动物的保护遗传学研究中将会起到越来越重要的作用，并且从保护生物学和道义上讲该方法都是最佳的研究方法。2．2 毛囊毛发的非损伤性取样已在分子生态学中得到了广泛的应用。研究中通过搜集动物脱落或被树枝刮落的毛发来进行毛发的非损伤性取样。毛发中的DNA主要集中在毛囊细胞中。在从动物体上采集或脱落的毛发中，绝大多数都带有完整的毛囊。从毛囊中提取DNA，通常采用直接经蛋自酶K消化后，再用酚氯仿多次抽提的方法或蛋自酶K消化与Chelex-100相结合的方法。Chelex-100是一种对多价金属离子具有高亲合力的螯合树脂，在高温条件下一些金属离子可以作为DNA降解的催化剂，而Chelex则能通过螯合这些金属离子来阻止DNA的降解，这样可从微量样品中得到较高分子量的DNA，再通过PCR反应获得足量的DNA进行序列测定。由于这种方法快速、简便，且提取的产物完全能满足序列测定的需要，因而在许多濒危物种的保护遗传学研究中得到了广泛的应用。在毛发中除了毛囊外，还有微量DNA存在于毛干的髓质中。然而，从毛干髓质获取微量的DNA要求严格的操作，而且提取DNA所用的毛干部位距毛根越远越不容易得到，因此这种方法在实际应用中受到了限制，仅用于没有毛囊或毛囊已败坏而毛发样品又很难得到的情况。2．3 馆藏标本馆藏标本包括了动物干皮标本、浸泡于福尔马林液中的标本组织以及骨骼。从保护遗传学的角度考虑，首先，馆藏标本取样方便而且相对于粪便和毛囊的非损伤性取样选材范围较广；其次，可利用不同年限的馆藏标本对动物的遗传变异及遗传多样性进行研究分析，这样就为制定相关的保护措施提供了可能。从馆藏标本中提取DNA不仅受到标本性质、保存方式、DNA样品性质等因素的影响，还受到提取方法的影响。饶刚等针对皮张标本中角蛋白对蛋自酶K有较强的耐受性这一特点，对前处理过程中的消化液组分进行了调整，以钙盐代替钠盐，大大增强消化液的消化效果。另外，方盛国等建议用逐步脱水和临界点干燥法处理福尔马林标本。实验证