以葡萄糖为生长相基质重组毕赤酵母表达植酸酶发酵.pdfVIP

第39卷第4期 工业微生物 Vd．39No．4 2009年8月 Industrial Aug．2009 Microbiology doi：10．3969／j．issn．1001—6678．2009．04．003 以葡萄糖为生长相基质的重组毕赤酵母表达植酸酶发酵 杭海峰， 叶新嗥， 郭美锦， 储炬， 庄英萍， 张嗣良。 (华东理工大学，生物反应器工程国家重点实验室，国家生化工程技术研究中心，上海200237) 摘要 甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白是在醇氧化酶(alcohol 严格调控下进行的，然而这种启动子在转录水平受到葡萄糖的阻遏。本文研究了毕赤酵母在葡萄 糖替代甘油为生长相碳源时表达重组植酸酶蛋白的发酵特征。结果表明：初始葡萄糖浓度为20d L的细胞得率高，为0．39 g[r)CW]／g。通过基于实时参数(溶氧和呼吸商)调控的葡萄糖补料策 F1U 略，生长相40h后细胞密度达到100 h后植酸酶产量达到2200 g[DCW]／L，甲醇诱导100 methnol。因此，在毕赤酵母高表达重组蛋白培 phytase／mL，甲醇得率系数为0．25聊mphytase／g 养中葡萄糖能够用作生长相基质，并能实现重组蛋白的高效表达。 关键词：毕赤酵母；植酸酶；葡萄糖；补料策略 植酸酶的作用是催化植酸降解为肌醇或单磷酸 遏，去阻遏机制和诱导机制，当缺少阻遏碳源时(例 肌醇并释放出植酸磷，如果在饲料中添加植酸酶，不 如葡萄糖)AOXl并不能表达，只有在甲醇诱导下 仅可以促进磷的吸收，还可以提高饲料中钙、锌、蛋 AOXl基因才能高表达【2】。因此重组毕赤酵母表达 白质和氨基酸的利用率，降低磷排出，减少环境污 外源蛋白通常分为2个阶段：第一阶段是生长相，获 染。因此植酸酶在饲料工业中的大规模应用，对提 得足够的生物量，通常以甘油为生长相基质；第二阶 高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染都具 段为诱导相，仅流加甲醇为唯一碳源来诱导外源蛋 有重要意义。随着基因工程技术的发展，很多植酸 白的表达。近年来，人们又研究了混合补料策略来 酶基因已经从植物、微生物及真菌中得到分离并在 提高重组毕赤酵母发酵的产率，特别是对于一些 utilization 微物系统中表达，例如高效表达植酸酶的基因工程 Mut(methanolslow)表型的系统，通过这 毕赤酵母(1]，并已开始实现植酸酶的产业化生产。 种甘油／rp醇的混合补料，既可以实现细胞较好的生 甲醇营养型毕赤酵母是研究和运用很广泛的外 长，又可以诱导产生外源蛋白【4】。然而由于是同时 源蛋白表达系统，目前已有超过400种蛋白得到表 流加阻遏碳源甘油和诱导物甲醇，过程控制比较复 达[2]。这种系统的优点包括：(1)外源蛋白的高表杂，而且由于残留甘油的阻遏作用很难实现高产，因 达；(2)外源蛋白分泌的高效率；(3)高效转录后修此人们又研究用非阻遏性碳源(例如山梨醇)替代甘 饰，例如糖基化；(4)可以实现高密度培养[3]。醇氧油来实现混合补料bJ。 化酶(alcohol oxidase，AOX)是甲醇营养型毕赤酵母葡萄糖是发酵领域常用的一种培养碳源，其价 系统中的关键酶，也是甲醇代谢途径中的第一个酶。 格和甘油、山梨醇以及其他非阻遏性碳源相比具有 毕赤酵母中