第6章—常用分子生物学技术.pptVIP

第四节 RNA干扰技术 RNA干扰（RNA interference，RNAi）是内源和外源性双链RNA（dsRNA）在生物体内诱导同源基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的技术。 RNAi的作用机制 1.起始阶段 dsRNA被Dicer酶加工成为siRNA siRNA特征：1）长度为21-23nt;2)两条链都有2nt的3’突出端;3)与靶mRNA序列同源。 2.效应阶段 1）siRNA与解旋酶、ATP及多个蛋白形成RISC. 2）RISC与靶mRNA结合,在ATP依赖的解siRNA双链的过程中激活RISC。 3）激活的RISC通过碱基配对定位到靶mRNA正确位点，并切割靶mRNA。 4）mRNA残片或者被降解，或者作为模板合成新的dsRNA，形成放大效应。 RNAi的作用特点 1.具有高度特异性 2.具有高效性 3. 受多基因控制 4.需siRNA介导 5.对靶基因位点具有选择性 6.具有放大效应 siRNA表达载体和siRNA表达框 siRNA表达载体的优点：带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续时间为数周或更久。 siRNA表达框的优点：可直接由PCR得到，不需要载体克隆、测序等费时的步骤，是筛选siRNA最有效的工具。 常用分子生物学技术 复旦大学药学院药理与生化教研室 第一节 分子杂交技术 一、Southern 印迹（Southern blot） 二、 Northern印迹（Northern blot） 三、 Western印迹 （Western blot） 四、原位杂交（in situ hybridization） 五、生物芯片（biochip） Southern blot步骤 DNA样品经RE降解 核酸电泳，DNA变性 核酸转印 烤膜 预杂交，封闭 探针杂交 洗膜 显影 Southern blot中的核酸转印 Southern blot在RFLP中的应用 限制片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism） 不同的个体DNA分子因发生点突变、缺失、插入或重排，当用特异的限制性内切酶切割所得到的基因片段、长度发生了改变。 可用于基因的定位、作图等研究 Western blot的步骤 蛋白样品的准备 SDS蛋白转印 封闭 一抗孵育 洗膜 二抗孵育 洗膜 显影、拍照或胶片曝光 SDS-PAG及电泳槽 SDS（染色后） Western blot实验中，凝胶一般不染色直接转印。 凝胶转印装置 Plasma apolipoproteins in SMSr mice Apo B-48 Apo B-100 Apo A-I Apo E SMSr WT(male) SMSr KO(male) Macrophage MAPK system total P38 p- P38 β- actin p- JNK SMSr KO SMSr WT LPS(ng/ml) 0 100 200 0 100 200 SMSr KO SMSr WT 0 100 200 0 100 200 total ERK p- ERK β- actin LPS(ng/ml) SMSr KO SMSr WT 0 100 200 0 100 200 β- actin Total JNK LPS(ng/ml) p- JNK SMSr KO SMSr WT 0 100 200 0 100 200 β- actin IκBα LPS(ng/ml) 原位杂交（in situ hybridization） 准备细胞爬片（或组织切片） 固定 透明 一抗孵育 洗片 二抗孵育 洗片 显影、照相 LPS(1μg/ml,15min.) Without LPS TGN46是高尔基体标志物，WGA是细胞膜标志物，TOPRO-3是细胞核标志物 生物芯片-基因芯片 第二节 目的基因制备技术 一、聚合酶链式反应（PCR） 1.PCR体系的基本成分 模板，特异性引物，热稳定的DNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸，二价阳离子，缓冲液、一价阳离子。 PCR反应的基本原理 PCR的应用 1.扩增目的基因 2.引入突变位点或RE位点 3.RT-PCR半定量RNA表达水平 4.Realtime PCR定量RNA表达水平 5.基因型鉴定，法医鉴定等。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 WT Positve control SMS2(+/+):10 SMS2(+/-):1,2,3,4,8 SMS2(-/-):5,6,7,9 2012年2月7日检测 基因敲除小鼠基因型检测 tissue distribution of SMSr liver heart spleen lung kidney muscle Adipose tes