家蝇外切多聚磷酸酶(PPX)片段基因的克隆及原核表达载体构建.pdfVIP

家蝇外切多聚磷酸酶(PPX)片段基因的克隆及原核表达载体构建 专业名称：细胞生物学 研 究 生：杨虓 导 师：张春林 教授 吴建伟 教授 摘要：目的：克隆家蝇外切多聚磷酸酶（PPX）片段基因的cDNA 序列，并对PPX 基因进行生物信息学分析，构建该基因的原核表达载体。方法：根据已知抗菌肽 N 端氨基酸序列设计简并引物，采用3’race 技术对其进行序列延伸；根据3’ race 结果设计引物，扩增家蝇 PPX 基因序列并对其进行生物信息学分析，构建 家蝇PPX 基因重组原核表达质粒并鉴定。结果：家蝇PPX 基因的cDNA 长660bp， 编码219 个氨基酸。生物信息学分析显示家蝇PPX 是一个分子量24.7867kD，等 电点为8.4，不稳定参数45.58，脂溶指数 99.27，不具跨膜区和信号肽的亲水 蛋白。其主要构成元件为α螺旋、β折叠和无规则卷曲及少部分的β转角。三维 结构预测显示该蛋白高度复杂卷曲。系统同源性分析显示PPX 基因在进化过程中 高度保守。根据克隆的家蝇PPX 基因成功构建 PPX 基因的原核表达载体，获得 融合组氨酸（HIS）标签的 pET28a （+）- PPX 重组质粒。结论：成功克隆家蝇 PPX 基因，并对其蛋白质结构及功能进行预测；基于克隆出的 PPX 基因，成功构 建家蝇PPX 基因原核表达载体，为今后进一步研究家蝇PPX 基因的功能奠定了基 础。 关键词：家蝇；ppx；生物信息学;原核表达载体构建 3 前言 外切多聚磷酸酶（PPX）是多聚磷酸盐（polyP）代谢中的主要酶，它能持续 水解 polyP，在 polyP 的末端逐一切断磷酸酐键，释放polyP 的末端磷酸基，使 [1] 其成为单磷酸盐 。根据其结构差异，可分为两类：一类是存在于真细菌和古细 菌中的 PPX，他们属于一个超家族，包括糖激酶、肌动蛋白、热休克蛋白 70（HSP70） 以及原核细胞周期蛋白。另一类是酿酒酵母、真菌和原虫中的PPX，它们属于DHH 磷酸酯酶超家族[2,3]。PPX 能水解细菌中储存的 polyP，为ATP 的产生提供所需能 量，并使细胞内的乙酸活化产生乙酰辅酶 A，进而调节细菌基因的表达、运动、 生物膜形成等生理活动，并与代谢过程密切相关[4,5]。过表达 PPX 的蜡状芽孢杆 [6] 菌突变体表现出了生物被膜形成缺陷、孢子(芽孢)形成数量和效率的降低 、运 [7] 动结构表达异常 。这些改变往往降低了其适应环境的能力,对抗生素的敏感性 增加、对恶劣环境 (如酸、热、高渗等)的耐受性降低,与此同时突变体的捕食能 力和抵抗天敌的能力也出现明显降低[8,9],毒力下降或丧失[8] 。人类乳腺癌细胞系 MCF-7 中表达的酵母PPX 能显著抑制丝裂原、胰岛素或氨基酸激活 mTOR 的能力， 还可抑制 MCF-7 在无血清培养基上的增殖[10-12]。向流感嗜血杆菌外膜磷脂双分子 层加入酿酒酵母 PPX 时，阳离子选择透过能力降低,膜两侧的极性减弱,对称性增 强[13,14]。PPX/GPPA 在细菌的生命活动中至关重要，大肠杆菌中存在两种 PPX，即 PPX1 和 PPX2(鸟苷五磷酸磷酸水解酶 GPPA)，大肠杆菌PPX2 能够持续水解 polyP 或水解鸟苷五磷酸成为鸟苷四磷酸，释放 Pi 基团和能量，进一步参与 ATP 的合 成。 目前对于PPX 的研究仍然非常有限，并且大多数局限于低等生物，其他物种 一般仅是报道有 PPX 酶活性存在,但并未对其进行相关分子生物学研究，如：在 一种利什曼原虫中发现发现了一种焦磷酸酶，可以水解 polyP；锥虫酸性钙小体 具有 PPX 的活性，其中钙离子释放的同时伴随着polyP 的水解；人脑、肝、外周 血单核细胞、红细胞、成骨细胞、成纤维细胞等具有较高水平 polyP 的细胞中能 [15-18] [1] 检测到高水平的 PPX 活性