多质粒共转化组合筛选方法构建木糖利用酿酒酵母的研究.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（１２）：８６９７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 多质粒共转化组合筛选方法构建木糖 利用酿酒酵母的研究    刘宝利 　刘高冈 　林秋卉　李炳志 　元英进 （天津大学化工学院　系统生物工程教育部重点实验室　天津化学化工协同创新中心　天津　３０００７２） 摘要　快速得到目标代谢路径相关基因的大量组合以及实现组合库的高效筛选，是合成生物学 领域中一个重要的研究内容。建立了三质粒共转化酵母菌株组合筛选方法并以ＸＲＸＤＨ木糖代 谢路径在酿酒酵母中的应用为例进行阐释。首先利用ＹｅａｓｔＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ连接法在三种不同表达 载体上构建不同启动子控制下的ＸＲ、ＸＤＨ、ＸＫ单个基因的表达盒，然后直接用三质粒共转化系 统构建１００种不同组合的重组酵母。经过木糖平板初筛筛选出１６个能利用木糖的组合，将这１６ 个组合对应的三基因表达模块组装至同一表达载体后转化底盘菌株，再通过限氧发酵进行复筛， 最终筛选出木糖代谢能力、木糖醇和乙醇生成速率最优菌株ＳｃＬＱＨ３５（ＴＤＨ３ｐＸＲＡＣＳ２ｔＦＢＡ１ｐ ＸＤＨＥＮＯ２ｔＰＤＣ１ｐＸＫＡＳＣ１ｔ），在培养基中含有２０ｇ／Ｌ木糖的条件下，其木糖醇产量为７．１４ ｇ／Ｌ，乙醇产量为５．９２ｇ／Ｌ，而菌株 ＳｃＬＱＨ３９（ＴＤＨ３ｐＸＲＡＣＳ２ｔＦＢＡ１ｐＸＤＨＥＮＯ２ｔＺＥＯ１ｐＸＫ ＡＳＣ１ｔ）则表现出较强的木糖醇生产能力，特别在限氧发酵时，其木糖醇得率可高达０．７１ｇ／ｇ。三 质粒共转化组合筛选方法实现了木糖利用菌株的灵活构建和快速筛选，并成功得到具有优良木 糖利用性能的酿酒酵母菌株，表明其在重组菌株的构建和筛选工作中有一定的应用价值。 关键词　合成生物学　酿酒酵母　共转化　组合筛选　木糖利用 中图分类号　Ｑ８１５ 　　合成生物学和代谢工程领域的一个主要挑战，是 　　酿酒酵母的木糖利用是纤维素乙醇工业化生产的 实现底盘菌株内源和外源代谢模块之间的适配，获得 一个限制因素，木糖是木质纤维素原料中含量次高的 高产目标产物的菌株。实现模块间的适配，主要是为 单糖，其有效利用可以大幅度提高原料利用率。现有 了避免基因过表达带来的代谢负担、辅因子特异性造 的木糖利用酿酒酵母工程菌株，普遍引入了自然界中 成的辅因子不平衡以及不稳定或有毒中间产物积累造 ［８］ 天然存在的木糖代谢途径 。其中一条是广泛存在于 成的生长抑制等［１３］。以往的研究中，最常见的平衡代 树干毕赤酵母等真菌中的木糖还原酶木糖醇脱氢酶途 谢流的方法包括过表达关键基因、删除支路基因以及 径（简称ＸＲＸＤＨ途径），在这条途径中木糖醇脱氢酶 利用蛋白质工程改造关键酶的活性；改造元件通常包 和木糖还原酶的辅因子偏好性不同，会导致细胞内氧化 括基因（密码子）、启动子和基因调控核糖体结合位点 还原力的失衡，最终造成木糖醇的积累和乙醇得率的降 ［４６］ （ＲＢＳ）等 。随着合成生物学以及人工合成基因组 ［９］ 低 。此外，有研究表明ＸＫ表达量过高或过低都会影 的发展，对底盘细胞的改造已经由单点改造变成模块 ［１０］ 响细胞生长，从而影响产物的得率 。因此，在 ＸＲ